Identification of de-regulated circulating microRNAs as putative biomarkers in amyotrophic lateral sclerosis

Tese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2023A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa heterogénea, progressiva e fatal, caracterizada pela degeneração dos primeiro e segundo neurónios motores, causando atrofia muscular, paresia e, mesmo, morte após 2 a 5 anos do início dos sintomas. O nome foi cunhado por Jean-Martin Charcot, no século XIX, e reflete a degeneração dos neurónios motores corticospinais (esclerose lateral) e a atrofia muscular secundária devido ao desaparecimento dos neurónios motores medulares. Não há tratamento eficaz para a ELA e o diagnóstico é um exercício clínico apoiado por estudos neurofisiológicos e de neuroimagem. Os atrasos no diagnóstico são um enorme desafio na gestão da doença e o diagnóstico precoce é crucial para uma gestão clínica eficaz. Estes atrasos no diagnóstico, que possivelmente vão além da janela de oportunidade terapêutica, combinados com a heterogeneidade clínica e a complexidade destas doenças trazem a necessidade de um biomarcador de diagnóstico e prognóstico. A identificação de um biomarcador fiável permite um diagnóstico mais precoce e, portanto, uma entrada mais precoce em ensaios clínicos, aproximando-nos assim do objetivo de encontrar um agente farmacológico capaz de travar a degeneração dos neurónios motores. O biomarcador ideal deve exibir alta sensibilidade e especificidade para distinguir a ELA de outras doenças neurológicas, e para monitorizar a progressão da doença. A procura de biomarcadores relacionados com a ELA tem sido predominantemente realizada utilizando o líquido cefalorraquidiano (LCR), devido à sua relação próxima com o Sistema Nervoso Central (SNC). Embora o LCR represente uma fonte importante de biomarcadores, não é adequado para screening de primeira linha e para estudos repetidos ao longo da progressão da doença. Devem ser feitos esforços para tentar identificar biomarcadores sensíveis e especificos no sangue, pois é fácil de obter e manusear, permite múltiplos testes a baixo custo, e é o procedimento menos invasivo. Uma classe de moléculas que tem sido cada vez mais investigada como potenciais biomarcadores para ELA são os microRNAs (miRNAs). Os miRNAs são RNAs não codificantes de 20 a 25 nucleótidos, evolutivamente conservados, e que regulam os processos biológicos em organismos eucarióticos através da clivagem ou repressão translacional dos RNAs mensageiros (mRNA), modulando, assim, vários processos fisiológicos. Para mais, várias proteínas relacionadas com ALS (tais como TDP-43 e FUS) estão envolvidas na biogénese dos miRNAs. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar um conjunto de miRNAs no plasma sanguíneo de pacientes com ELA, que possuíam o potencial para ser possíveis biomarcadores de diagnóstico e prognóstico. Identification of de-regulated circulating microRNAs as putative biomarkers in Amyotrophic Lateral Sclerosis Para atingir o objetivo, utilizámos amostras de plasma sanguíneo de três grupos diferentes, nomeadamente, doentes com ELA (35), doentes com outras doenças que mimetizam a ELA (16) e controlos saudáveis (15). Num projeto anterior identificámos 10 miRNAs desregulados em amostras de plasma combinadas de pacientes com ELA. No estudo atual comparámos a expressão relativa destes miRNAs em amostras individuais de plasma entre os 3 grupos. Tendo em conta que 16 dos nossos 35 doentes com ALS possuíam 3 colheitas de sangue distintas e separadas no tempo, também realizámos uma análise longitudinal. Comparamos as amostras dos 16 doentes entre as 3 diferentes colheitas. O RNA total em cada amostra foi purificado de acordo com o protocolo miRNeasy® Serum/ Plasma Advanced Kit (QIAGEN). Um PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) com kits de ensaio TaqMan miRNA (ABI) foi utilizado para quantificar a expressão miRNAs. Os resultados foram analisados por software aconselhado pelo fabricante e combinados com um conjunto de dados clínicos que permitiu o agrupamento dos doentes em diferentes subgrupos: sítio de início da doença (medular ou bulbar), neurónio motor predominante (superior ou inferior), velocidade de progressão (lenta ou médio/rápida), capacidade vital forçada (normal ou anormal) e género (feminino ou masculino). Também foi realizada uma análise de enriquecimento para uma melhor compreensão da ação dos miRNAs menos associados à ELA. As comparações de expressão relativa de miRNAs entre as amostras dos três grupos revelaram que apenas o hsa-miR-7-2-3p apresentava diferenças significativas de expressão entre grupos (entre doentes ELA e doentes com doenças que mimetizam ELA). Este miRNA não se expressou de todo em nenhuma das amostras do grupo de doentes com perturbações que mimetizam a ELA. Quando introduzimos os dados clínicos dos doentes, e os separamos consoante os mesmos, o hsa-miR-7-2-3p também se encontrou diferentemente expresso entre o subgrupo de pacientes ELA com início medular quando comparado com o subgrupo de início bulbar. Estes resultados combinados com a nossa análise de enriquecimento apontam para um possível papel protetor deste miRNA na doença. Na análise longitudinal apenas o hsa-miR-224-5p obteve diferenças significativas em termos de expressão relativa entre colheitas (entre a 2.ª e a 3.ª). Este miRNA também apresenta diferenças significativas na sua expressão entre o subgrupo de progressão de doença lenta e o subgrupo de progressão de doença média/rápida. A análise de enriquecimento demonstrou o envolvimento deste miRNA em várias vias afetadas na ELA, contudo, e tendo em consideração todos os resultados obtidos, o hsa-miR-224-5p não revelou ter potencial como biomarcador. Tal como o hsa-miR-224-5p, o hsa-miR-26a-1-3p também revela algumas diferenças significativas de expressão relativa entre alguns dos subgrupos (início medular vs início bulbar). A análise de enriquecimento revela que este miRNA está envolvido na Identification of de-regulated circulating microRNAs as putative biomarkers in Amyotrophic Lateral Sclerosis via p53 e na via de doenças de priões. Nenhum dos resultados aponta para algum tipo de potencial do hsa-miR-26a-1-3p como biomarcador. Os resultados mais positivos deste estudo foram obtidos com o hsa-miR-206, o miRNA mais promissor e mais investigado no contexto da ELA. Este miRNA intervém na regeneração de sinapses neuromusculares e na reinervação muscular, tendo um papel protetor na ELA. A hipótese proposta por alguns autores é que o hsa miR-206 tem um pico de expressão no início da doença em resposta à degeneração provocada pela mesma. Este pico de expressão atinge, eventualmente, um plateau e começa a baixar. Por este motivo, o hsa-miR-206 é visto como um bom indicador para ELA com progressão lenta. Os nossos resultados apontam para a mesma hipótese, tendo em conta que encontramos este miRNA sobre-expresso no subgrupo de início medular e no subgrupo de progressão lenta. Apesar de promissores, é preciso interpretar estes resultados com cautela. O poder preditivo do hsa-miR-206 para doentes com progressão lenta pode ser muito útil na investigação clínica, mas uma doença tão heterogénea e complexa como ELA dificilmente é explicada por apenas um miRNA. Apesar de alguns resultados promissores que apontam para novos miRNAs envolvidos na fisiopatologia da doença, bem como resultados que reforçam o papel do hsa-miR-206 na ELA, o nosso projeto não permitiu identificar nenhum miRNA com potencial de biomarcador de prognóstico ou diagnóstico de aplicabilidade clínica. Ainda assim, os miRNAs representam uma importante fonte de informação sobre diferentes vias celulares, e, em doenças complexas como a ELA, representam um alvo de estudo valioso. A falta de consenso neste campo é um dos maiores entraves ao seu desenvolvimento: estudos são realizados utilizando diferentes tecidos e metodologias. Para mais, muitos dos estudos são realizados em populações de tamanho reduzido, pondo em causa a real validade dos seus resultados. Outras variáveis, como por exemplo a ancestralidade da população estudada, também influenciam os resultados obtidos. Surge, portanto, a necessidade de ser estabelecida uma metodologia padrão para avaliar os níveis de expressão das miRNAs na ELA. Mesmo assim, será sempre imperativo ter em consideração a heterogeneidade da doença, os múltiplos fenótipos e mecanismos fisiopatológicos, a vasta gama de funções fisiológicas e vários alvos diferentes de miRNAsAmyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a heterogeneous and progressive neurodegenerative disease. Diagnostic delays are a challenge in the management of ALS, thus sensitive diagnostic and prognostic biomarkers are needed. Blood-based biomarkers, such as microRNAs (miRNAs) are ideal for first-line screening tests. We previously identified 10 dysregulated miRNAs in pooled plasma samples of ALS patients. We here verified these de-regulated miRNAs and combine these results with clinical phenotypes. A longitudinal assessment of the miRNAs signatures in ALS patients was also performed. The study population consisted of 3 groups: ALS (35), mimic disorders (16), and healthy controls (15). Total RNA in each sample was purified according to the miRNeasy® Serum/ Plasma Advanced Kit (QIAGEN) protocol. A quantitative real-time PCR (qRT-PCR) with TaqMan miRNA assay kits (ABI) was used to quantify miRNAs expression. The results were analyzed by manufacturer-advised software and combined with a set of clinical data. No significant differences in relative expression were observed between groups in 7 of the 8 miRNAs considered. Only hsa-miR-7-2-3p was overexpressed in the ALS group compared with the MD group, where it was not expressed at all. In the longitudinal analysis, only miRNA-224- 5p showed significant differences between collections. When clustering our groups using the clinical data hsa-miR-206, hsa-miR-26a-1-3p, hsa-miR-7-2-3p, and hsa-miR-224-5p were significantly dysregulated between some subgroups. An enrichment pathway analysis was performed to better understand the miRNA pathway´s interaction. Although some promising results were obtained, we should analyze them with caution. Even though hsa-miR-206 reveals predictive potential, single biomarkers cannot explain most complex diseases. Nevertheless, miRNA might shed light on ALS pathophysiology. More studies following the same standard methodology are needed to validate the real utility of miRNAs as biomarkers in ALS

The unusual Kuiper belt object 2003 SQ317

We report photometric observations of Kuiper belt object 2013 SQ317 obtained between 2011 August 21 and 2011 November 1 at the 3.58 m New Technology Telescope, La Silla. We obtained a rotational lightcurve for 2013 SQ317 with a large peak-to-peak photometric range 0.85+/-0.05 mag, and a periodicity, P=7.210+/-0.001 hr. We also measure a nearly neutral broadband colour B-R=1.05+/-0.18 mag and a phase function with slope beta=0.95+/-0.41 mag/deg. The large lightcurve range implies an extremely elongated shape for 2013 SQ317, possibly as a single elongated object but most simply explained as a compact binary. If modelled as a compact binary near hydrostatic equilibrium, the bulk density of 2013 SQ317 is near 2670 kg m^(-3). If 2003 SQ317 is instead a single, elongated object, then its equilibrium density is about 860 kg m^(-3). These density estimates become uncertain at the 30% level if we relax the hydrostatic assumption and account for solid, "rubble pile"-type configurations. 2013 SQ317 has been associated with the Haumea family based on its orbital parameters and near-infrared colour; we discuss our findings in this context. If confirmed as a close binary, 2013 SQ317 will be the second object of its kind identified in the Kuiper belt.Comment: 8 pages, 10 figures, 4 tables. Submitted to MNRA

Experimental and numerical assessment of the impact test performance between two UHSS toe cap models

This paper presents an integrated approach for an ultimate high-performance safety toe cap with significant milestones in slim design and weight saving. The study of crashworthiness properties was performed through impact-crash test conditions exploring the potential of applicant solutions by the combination of an advanced high-strength steel and enhanced geometric stiffening models. The structural response for a significant thickness reduction was assessed and it provides an evolved discussion for improvements in energy absorption capacity. The present case study focuses on two geometric models from the S3 slim toe cap development by prototypes made of a martensitic 1200 steel alloy. The comparison of results is complemented using numerical simulation models with mathematical description of the dynamic plasticity behaviour by applying a constitutive Cowper-Symonds equation with fundamental parameters for material strain-rate dependence.Acknowledgments The funding support from Projects I&DT Project S3 - Safety Slim Shoe, FCOMP-01-0202-FEDER-018458 is acknowledged

Analysis of masonry walls subjected to high strain rate out-of-plane loads with a rate dependent interface model

Masonry is a composite material composed of individual units laid in and bound together by mortar. Appropriate Understanding of masonry material properties results in secure and efficient protection and strengthening of historical structures. Due to high computation costs and difficulties deal with detailed modelling of masonry structures, few studies are available in open literature dedicated to micro numerical modelling of masonry structures subjected to blast loading. In present study, the objective is to propose a dynamic interface model obeying non-associated flow rule with high strain rate effects to apply as material model for interface elements. In order to introduce the strain rate effects of brick and mortar properties, a recent developed model is applied here. Verifying the capability of the model proposed, numerical simulations are carried out to investigate the behaviour of unreinforced brick masonry walls subjected to explosive blast loading by using the finite element (FE) code ABAQUS. The results obtained are compared with field test data to find good agreement. A comprehensive parametric analysis is finally accomplished with different main material properties to evaluate the effect of each parameter on high strain rate response of masonry walls

Development of forming tool concept validator with variable stiffness blank-holder for high strength steel applications

This paper presents numerical and experimental results of a prototype tool that includes blank-holder elements of variable stiffness. The application is developed for high-strength steel applications aiming to achieve improvements in the forming operation, namely expand the limits of formability for the tested materials. A numerical model was built including material constitutive models description for the high-strength steel grades used while a forming tool was designed and constructed in order to evaluate the proposed concept. The obtained experimental and numerical results show a positive geometry control and reduction of failure risk. These results are a contribution to the validation of a variable-stiffness blank-holder concept for this particular case study.The funding support from Projects I&DT AdvancedTOOLING CENTRO-01-0247-FEDER-011399 and METRICS Ref. 2019 - UID/ EMS/04077/2019 is acknowledged

Implementation and validation of a strain rate dependent anisotropic continuum model for masonry

A newly developed strain rate dependent anisotropic continuum model is proposed for impact and blast applications in masonry. The present model adopted the usual approach of considering different yield criteria in tension and compression. The analysis of unreinforced block work masonry walls subjected to impact is carried out to validate the capability of the model. Comparison of the numerical predictions and test data revealed good agreement. Next, a parametric study is conducted to evaluate the influence of the tensile strengths along the three orthogonal directions and of the wall thickness on the global behavior of masonry walls.This work was performed under Project CH-SECURE, with reference TDC/ECM/120118/2010, funded by the Portuguese Foundation of Science and Technology - FCT. The authors acknowledge the support. The first author also acknowledges the support for the Strategic Planning of the School of Engineering from University of Minho

Dynamic interface model for masonry walls subjected to high strain rate out-of-plane loads

The present study proposes a dynamic constitutive material interface model that includes non-associated flow rule and high strain rate effects, implemented in the finite element code ABAQUS as a user subroutine. First, the model capability is validated with numerical simulations of unreinforced block work masonry walls subjected to low velocity impact. The results obtained are compared with field test data and good agreement is found. Subsequently, a comprehensive parametric analysis is accomplished with different joint tensile strengths and cohesion, and wall thickness to evaluate the effect of the parameter variations on the impact response of masonry walls

Testing and analysis of masonry arches subjected to impact loads

A prototype single span masonry arch was designed and its capacity was assessed both experimentally and numerically. The geometric design process was based on the dimensional-constraints of the laboratory. A quasi-static experimental test was conducted on the arch and the force deformation behaviour of the arch was obtained. Joint interface properties might play an important role in numerical assessment of masonry stone bridges; therefore the influence of these parameters is addressed. A sensitivity numerical analysis was carried out to figure out the range of values that gives similar global behaviour of the arch from both numerical and experimental simulations. Subsequently, the results of the impact test are given and a numerical simulation able to capture the main characteristics of the response is presented