La présence intrigante de la myéloperoxydase dans les cellules épithéliales de la prostate, serait-elle impliquée dans les lésions prostatiques ?

La myéloperoxydase (MPO) est une enzyme pro-oxydante qui est capable de causer des dommages aux biomolécules, comme les acides nucléiques, en les chlorant spécifiquement par le biais de l’acide hypochloreux (HClO) qu’elle produit. La MPO étant présente au sein de tissus prostatiques et impliquée dans divers mécanismes physiopathologiques (incluant les cancers), il nous semblait important d’évaluer dans ce travail l’impact de sa présence dans le développement de lésions prostatiques ainsi que celui de la présence de nucléosides spécifiquement modifiés par la MPO sur la réplication, la transcription et la traduction.Dans un premier temps, des méthodes ont été développées afin de permettre l’analyse quantitative des nucléosides de l’ADN, de l’ARN, du pool cytoplasmique et du plasma. Des protocoles d’extraction et d’hydrolyse de l’ADN et de l’ARN ainsi que des protocoles de purification et de déphoshorylation des nucléosides libres (pool cytoplasmique et plasma) ont été développés ou adaptés afin de pouvoir ensuite séparer et quantifier les nucléosides par chromatographie liquide à ultra haute performance couplée à un spectromètre de masse Triple Quadupôle (LC/MSMS). La méthode analytique LC/MSMS a été développée et validée pour l’étude de six résidus modifiés :les 5‐chloro-(2’-désoxy)cytidines, les 8-chloro-(2’-désoxy)guanosines et les 8-oxo-(2’-désoxy)guanosines. Les quatre premiers étant des marqueurs spécifiques de la MPO et la formation des oxoguanosines pouvant être catalysée par l’enzyme (marqueur du stress oxydatif). Cette méthode a notamment l’avantage de présenter des limites de quantification plus faibles que dans la littérature, abaissant de 4 à 25 fois la sensibilité de la méthode selon le nucléoside.Deuxièmement, nous nous sommes attardés sur l’implication de la MPO dans le développement de lésions prostatiques, en recherchant la présence de ces nucléosides modifiés au sein de biopsies prostatiques de patients et de cultures cellulaires prostatiques traitées in vitro par la MPO, à l’aide des méthodes développées précédemment. Néanmoins, il s’est avéré qu’aucun chloronucléoside n’a été détecté dans ces cas de figure. Une méthode d’immunomarquage par fluorescence a également été développée afin d’essayer de colocaliser la présence de la MPO et son activité au sein de tissus prostatiques de patients souffrant de lésions prostatiques. Ce marquage avait pour but d’estimer l’activité réelle de la présence de MPO, et donc son rôle au sein de ces lésions prostatiques mais un phénomène d’autofluorescence n’a pas permis d’aboutir à des résultats.Finalement, l’étude du plasma de patients hémodialysés et de la pénétration intracellulaire de nucléosides modifiés depuis les liquides extracellulaires, tel que le plasma, vers le compartiment cellulaire ont été abordées. Ces expériences ont également été rendues possibles grâce aux méthodes développées et validés précédemment. Puisqu’il s’avère que les échantillons de plasma de donneurs sains et de patients contiennent de la 5-chlorocytidine et que cette dernière est capable de pénétrer in vitro dans les cellules prostatiques, l’aspect de l’incorporation de ces nucléosides au sein de l’ADN et l’ARN a également été approfondi. Il en résulte que seule la 5-chlorocytidine s’incorpore dans l’ARN lors de la transcription en présence de nucléosides modifiés dans le milieu alors qu’aucun nucléoside modifié ne s’incorpore dans l’ADN lors de sa réplication. Ce dernier point est probablement dû à une perte partielle ou complète de l’activité de certaines enzymes impliquées dans la réplication face aux chloronucléosides. De plus, l’étude du rendement de la traduction a montré que cette incorporation spécifique était accompagnée d’une importante réduction de la traduction de l’ARN en protéines.En conclusion, bien que ce travail ait permis d’établir une méthode LC/MSMS sensible, précise et exacte pour l’analyse de nucléosides modifiés (chlorés et oxydés) dans différentes matrices, il n’a pas permis de mettre en évidence des chloronucléosides dans les tissus prostatiques de patients et d'impliquer la MPO dans le développement de lésions prostatiques. Le rôle de la MPO dans les tissus prostatiques reste donc encore à élucider. De plus, ce travail a mis pour la première fois en évidence la présence de 5-chlorocytidine dans le plasma humain ;ce même nucléoside est capable de s’incorporer spécifiquement dans l’ARN, influençant fortement le rendement de la production de protéines, ce qui soulève encore des questions quant à son impact sur les fonctions et la viabilité des cellules en présence de 5-chlorocytidine dans le milieu extracellulaire.Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie)info:eu-repo/semantics/nonPublishe

Syndrome dépressif : modalités et difficultés de sa prise en charge pour le médecin généraliste. Une étude qualitative menée en région PACA

Objectif : comprendre et analyser la prise en charge du syndrome dépressif par le médecin généraliste et entendre son ressenti et ses appréhensions.Méthode : étude qualitative menée auprès de médecins généralistes installés en région PACA. Le recueil de données était effectué lors d’entretiens individuels semi-dirigés à l’aide d’un guide d’entretien. Les verbatims étaient étudiés selon une analyse phénoménologique thématique à l’aide du logiciel NVivo. Les résultats ont été recueillis, décrits puis interprétés par la même personne.Résultats : les médecins rencontrent de plus en plus souvent des patients qui présentent les symptômes d’un épisode dépressif caractérisé en consultation. L’étude révèle la difficulté de poser le diagnostic, mais aussi de le faire entendre au patient. La prise en charge, complexe et pluridimensionnelle, consiste le plus souvent en l’introduction de traitements médicamenteux, associée à la mise en place d’une psychothérapie. La gestion de la crise suicidaire paraît être la plus laborieuse et représente une source d’inquiétude pour le praticien. La coordination entre les différents acteurs de soins pourrait être améliorée, notamment dans le dialogue avec le psychiatre et les autres acteurs de la santé mentale comme le psychologue. Les médecins exprimaient plusieurs émotions, satisfaction ou anxiété dans la gestion de la pathologie, agacement voire colère envers le système de santé dont ils dépendent, et paraissaient très impliqués vis-à-vis de leur patient jusqu’à basculer dans la sympathie et la compassion. Conclusion : le syndrome dépressif est une entité complexe que le médecin généraliste est de plus en plus amené à rencontrer dans sa pratique courante puisque sa prévalence explose, c’est une tendance qui s’aggrave chaque année, avec un rebond particulièrement préoccupant à la suite de la pandémie du COVID-19.La place du médecin généraliste semble centrale dans cette prise en charge de par sa disponibilité, sa proximité avec le patient et sa capacité à organiser une prise en charge adaptée à celui-ci. Le diagnostic reste difficile et l’utilisation d’outils standardisés, notamment le score PHQ-9, paraît intéressant pour dépister et définir la gravité d’un épisode dépressif caractérisé dans la pratique courante. La prescription des médicaments n’est pas obligatoire mais souvent nécessaire dans les cas d’épisodes dépressifs majeurs, leur utilisation semble pouvoir être optimisée afin de limiter la prescription « empathique » de benzodiazépines et maximiser l’utilisation des antidépresseurs. La mise en place d’une psychothérapie est couramment proposée au patient, souvent associée au traitement médicamenteux; les études tendent à la proposer comme seul traitement des épisodes dépressifs mineurs à modérés. La coordination entre les différents soignants de la maladie psychiatrique peut être améliorée, d’une part avec le psychiatre de ville, pour simplifier l’accès à ses consultations, mais aussi avec le psychologue qui est amené à prendre une place plus importante dans la prise en charge du patient dépressif à l’avenir.Le médecin généraliste qui pratique l’écoute active et/ou la psychothérapie se voit endosser les souffrances et traumatismes de ces patients, ce qui à terme semble avoir des conséquences sur son propre état émotionnel, c’est une réalité dont nous devons avoir conscience afin de prévenir l’apparition de phénomènes d’évitement et d’épuisement

Phosphatidylethanolamine is a Key Regulator of Membrane Fluidity in Eukaryotic Cells

Adequate membrane fluidity is required for a variety of key cellular processes and in particular for proper function of membrane proteins. In most eukaryotic cells membrane fluidity is known to be regulated by fatty acids desaturation and cholesterol although some cells, such insect cells, are almost devoid of sterols synthesis. We show here that insect and mammalian cells present similar microviscosity at their respective physiological temperature. In order to investigate how both sterols and phospholipids control fluidity homeostasis we quantified the lipidic composition of insect SF9b and mammalian HEK 293T cells under normal or sterol-modified condition. As expected, insect cells show minimal sterols compared to mammalian cells. A major difference is also observed in phospholipid content as the ratio of phosphatidylethanolamine (PE) to phosphatidylcholine (PC) is inverted (four times higher in SF9 cells). In vitro studies in liposomes confirm that both cholesterol and PE can increase rigidity of the bilayer, suggesting that both can be used by cells to maintain membrane fluidity. We then show that exogenously increasing the cholesterol amount in SF9 membranes leads to a significant decrease in PE/PC ratio while decreasing cholesterol in HEK 293T cells using statin treatment leads to an increase in the PE/PC ratio. In all cases the membrane fluidity is maintained, indicating that both cell types combine regulation by sterols and phospholipids to control proper membrane fluidity.SCOPUS: ar.jinfo:eu-repo/semantics/publishe

Glycobiology analysis of Myeloperoxidase

Carbohydrates of glycoproteins, such as myleoperoxidase (MPO), play an important role in biosynthesis and influence properties of the mature protein such as solubility, stability, immunogenicity, or molecular recognition. In the case of MPO, five N-glycans sites were described in the literature (P. Van Antwerpen, J. Biol. Chem. 2010) and the activity of deglycosylated enzyme was decreased significantly by comparison with native enzyme. Indeed, at least 3 of the five glycosylation sites were able to interact with receptors or others membranes proteins; the others ones, localized at interface, contributes to dimer stabilization. Moreover, N-glycosylation of MPO could modulate the enzyme activity and could change in some pathologies. For example, a high mannose and a complex glycan structures were presented on residue N485 of MPO in samples from a leukemia patient (T. Ravnsborg, Bioch. Biophys. Acta, 2010). In this context, the development of mass spectrometry coupled to liquid chromatography that could quantify modifications sustained by the carbohydrate moiety of MPO, is of interest. After digestion by PNGase F from glycoproteins and a eventual permethylation, glycans analysis using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was carried out with different sources (ESI and APCI) and chromatographic systems.info:eu-repo/semantics/nonPublishe

Optimisation of parameters to improve protein sequence recovery by LC-MS/MS: application to apolipoprotein B-1000 and myeloperoxidase

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Oxidation of Apolipoprotein-B-100: a Proteomic Approach of Atherosclerosis

Atherosclerosis is an inflammatory disease characterized by the accumulation of lipids in the subendothelial space. Among the proatherogenic factors, the oxidative modifications of low-density lipoproteins (LDLs) are frequently mentioned. Apolipoprotein-B-100 (ApoB100) is the major protein of LDLs which stabilizes the particle, binds to the LDL receptor and plays a key role in lipoprotein metabolism. It is also a huge protein (550kDa) containing 4536 amino acids. Although many experiments have been done on copper-oxidized LDLs, other more physiological pathways of oxidation are known and myeloperoxidase (MPO) is one of them (1). MPO is indeed able to oxidize ApoB100 by catalysing the synthesis of hypochlorous acid (HOCl), a powerful oxidant, in the presence of hydrogen peroxide (H2O2) and chloride ions (2). However, the oxidative modifications of ApoB100 are still unclear. In order to determine characteristics of the specific MPO-dependent oxidation, we analyzed in vitro modifications of ApoB100 under 2 oxidative conditions: the oxidation of native-LDLs with (i) HOCl (to mimic MPO-oxidation), and (ii) the MPO/H2O2/Cl- system. ApoB100 was isolated from LDLs, digested using trypsin and the resulting peptides were analyzed by LC-autoMS/MS. As ApoB100 is a large protein, we optimized numbers of parameters involved in the analytical method and the data analyses, in order to increase the sequence coverage (79% instead of 50% in the literature) and to detect a maximum of modifications(3). The three major residues targeted by oxidative species were methionine, tryptophan and tyrosine, forming methionine sulfoxide, hydroxy-tryptophan and chloro-tyrosine, respectively. Although similar oxidized residues were detected in both conditions, several amino acids were specifically oxidized by MPO: 2 tyrosine residues (Y76 and Y1901) and some methionine residues (M723, M727, M1080, M1715, M1716 and M3986). ApoB100 modifications are therefore different under both experimental conditions, revealing important characteristics of the specific MPO-dependent oxidation, a physiologically relevant process. The MPO site-specific oxidations will be further examined in patients who present different clinical situations. (1) Daugherty and Roselaar, Cardiovascular Research 29 (1995). (2) Klebanoff, J Leukoc Biol 77 (2005). (3) Delporte et al. J. Anal. Biochem. 411 (2011).info:eu-repo/semantics/nonPublishe

In vitro effects of myeloperoxidase activity on DNA transcription and RNA translation

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Advancement in stationary phase for peptide separation helps in protein identification: Application to atheroma plaque proteomics using nano-chip liquid chromatography and mass spectrometry

In the last decades, proteomics has largely progressed. Mass spectrometry and liquid chromatography (LC) are generally used in proteomics. These techniques enable proper separation of peptides and good identification and/or quantification of them. Later, nano-scaled liquid chromatography, improvements of mass spectrometry resolution and sensitivity brought huge advancements. Enhancements in chemistry of chromatographic columns also brought interesting results. In the present work, the potency of identification of proteins by different nano-chip columns was studied and compared with classical LC column. The present study was applied to cardiovascular field where proteomics has shown to be highly helpful in research of new biomarkers. Protein extracts from atheroma plaques were used and proteomics data were compared. Results show that fewer spectra were acquired by the mass spectrometer when nano-chip columns were used instead of the classical ones. However, approximately 40% more unique peptides were identified by the recently optimized chip named Polaris-HR-chip-3C18 column, and 20% more proteins were identified. This fact leads to the identification of more low-abundance proteins. Many of them are involved in atheroma plaque development such as apolipoproteins, ceruloplasmin, etc. In conclusion, present data shows that recent developments of nanoLC column chemistry and dimensions enabled the improved detection and identification of low-abundance proteins in atheroma plaques. Several of them are of major interest in the field of cardiovascular disease.SCOPUS: ar.jinfo:eu-repo/semantics/publishe

Penetration of modified nucleosides in cultured cells and incorporation in RNA and DNA in cultured cells and incorporation in RNA and DNA

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DEVELOPMENT OF AN ANALYTICAL METHOD USING LC/MSMS TO QUANTIFY OXO(d)GUANOSINE AND CHLOROGUANOSINE IN URINE

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