Identification of proteins in laser-microdissected small cell numbers by SELDI-TOF and Tandem MS

BACKGROUND: Laser microdissection allows precise isolation of specific cell types and compartments from complex tissues. To analyse proteins from small cell numbers, we combine laser-microdissection and manipulation (LMM) with mass spectrometry techniques. RESULTS: Hemalaun stained mouse lung sections were used to isolate 500–2,000 cells, enough material for complex protein profiles by SELDI-TOF MS (surface enhanced laser desorption and ionization/time of flight mass spectrometry), employing different chromatographic ProteinChip(® )Arrays. Initially, to establish the principle, we identified specific protein peaks from 20,000 laser-microdissected cells, combining column chromatography, SDS-PAGE, tryptic digestion, SELDI technology and Tandem MS/MS using a ProteinChip(® )Tandem MS Interface. Secondly, our aim was to reduce the labour requirements of microdissecting several thousand cells. Therefore, we first defined target proteins in a few microdissected cells, then recovered in whole tissue section homogenates from the same lung and applied to these analytical techniques. Both approaches resulted in a successful identification of the selected peaks. CONCLUSION: Laser-microdissection may thus be combined with SELDI-TOF MS for generation of protein marker profiles in a cell-type- or compartment-specific manner in complex tissues, linked with mass fingerprinting and peptide sequencing by Tandem MS/MS for definite characterization

protection by adrenomedullin

Ventilator-induced lung injury (VILI) contributes to morbidity and mortality in acute respiratory distress syndrome (ARDS). Particularly pre-injured lungs are susceptible to VILI despite protective ventilation. In a previous study, the endogenous peptide adrenomedullin (AM) protected murine lungs from VILI. We hypothesized that mechanical ventilation (MV) contributes to lung injury and sepsis in pneumonia, and that AM may reduce lung injury and multiple organ failure in ventilated mice with pneumococcal pneumonia. We analyzed in mice the impact of MV in established pneumonia on lung injury, inflammation, bacterial burden, hemodynamics and extrapulmonary organ injury, and assessed the therapeutic potential of AM by starting treatment at intubation. In pneumococcal pneumonia, MV increased lung permeability, and worsened lung mechanics and oxygenation failure. MV dramatically increased lung and blood cytokines but not lung leukocyte counts in pneumonia. MV induced systemic leukocytopenia and liver, gut and kidney injury in mice with pneumonia. Lung and blood bacterial burden was not affected by MV pneumonia and MV increased lung AM expression, whereas receptor activity modifying protein (RAMP) 1-3 expression was increased in pneumonia and reduced by MV. Infusion of AM protected against MV-induced lung injury (66% reduction of pulmonary permeability p<0.01; prevention of pulmonary restriction) and against VILI- induced liver and gut injury in pneumonia (91% reduction of AST levels p<0.05, 96% reduction of alanine aminotransaminase (ALT) levels p<0.05, abrogation of histopathological changes and parenchymal apoptosis in liver and gut). MV paved the way for the progression of pneumonia towards ARDS and sepsis by aggravating lung injury and systemic hyperinflammation leading to liver, kidney and gut injury. AM may be a promising therapeutic option to protect against development of lung injury, sepsis and extrapulmonary organ injury in mechanically ventilated individuals with severe pneumonia

Kohlenhydratschätzung und Boluskalkulation zeigen differenzierte Assoziationen mit verschiedenen Indikatoren der glykämischen Kontrolle

Fragestellung: Für die Insulindosierung müssen Diabetespatienten mit einer intensivierten Insulintherapie auf der Basis des Kohlenhydratgehalts der Nahrungsmittel und den aktuellen Blutzuckerwerten den individuellen Bolus errechnen.Die vorliegende Studie untersucht den Einfluss der Fähigkeit zur Kohlenhydratschätzung und Boluskalkulation auf den HbA1c sowie der Blutzuckerkontrolle im Alltag. Methodik: Der SMART-Fragebogen zur Erfassung der Boluskalkulations- und Kohlenhydratschätzfähigkeiten wurde 114 Typ-1 und Typ-2-Patienten mit intensivierter Insulintherapie vorgelegt. Der HbA1c wurde im Zentrallabor gemessen. Zur Bestimmung der Blutzuckerkontrolle im Alltag wurden gespeicherten Blutzuckerwerte ausgelesen (> 56.000 Blutzuckermessungen wurden analysiert). Ergebnisse: Eine bessere Fähigkeit zur Boluskalkulation war signifikant mit einem niedrigeren HbA1c (r =-0,39, p < 0,05), einem niedrigeren mittleren Blutzucker (r =-0,29, p < 0,05) und einer geringeren Streuung der Blutzuckerwerte (r =-0,43, p < 0,05) assoziiert. Eine bessere Fähigkeit zur Boluskalkulation ging zudem mit weniger Hyperglykämien (r =-0,32, p < 0,05) und einem niedrigeren Nüchternblutzuckerwert einher (r =-0,25, p < 0,05). Die Fähigkeit zur Kohlenhydratschätzung zeigte eine niedrige Korrelation mit dem HbA1c (r =-0,14, p > 0,05), jedoch eine signifikante Assoziation mit einem niedrigeren mittleren Blutzucker (r =-0,3, p < 0,05) und einer niedrigeren Anzahl an Hyperglykämien (r =-0,27, p < 0,05). Ein höherer Anteil an euglykämischen Blutzuckerwerten (r = 0,26, p < 0,05) und ein niedrigerer Nüchternblutzuckerwert waren ebenfalls mit einer besseren Kohlenhydratschätzung assoziiert (r =-0,25, p < 0,05). Schlussfolgerungen: Eine bessere Fähigkeit zur Boluskalkulation geht mit einem besseren HbA1c, einem stabileren Blutzuckerverlauf und weniger Hyperglykämien im Alltag, eine gute Fähigkeit zur Kohlenhydratschätzung mit einem niedrigeren mittleren Blutzucker, weniger Hyperglykämien und einem höheren Anteil euglykämischer Blutzuckerwerte einher. Eine standardisierte Erfassung beider Fähigkeiten erscheint sinnvoll, um Patienten mit Defiziten zu identifizieren und diese bei einer Verbesserung zu unterstützen

Psychometrische Validierung eines Assessmenttools zur Einschätzung von Kohlenhydraten und Boluskalkulation für Diabetespatienten mit einer intensivierten Insulintherapie

Fragestellung: Die erfolgreiche Durchführung einer intensivierten Insulintherapie setzt voraus, dass ein Patient den Kohlenhydratgehalts von Mahlzeiten richtig einschätzt sowie die Menge des kurzwirksamen Insulins richtig berechnet. Bislang gibt es nur wenige Studien, zur Güte dieser Therapieentscheidungen von Patienten und darüber, in welchem Ausmaß Patienten therapierelevante Fehler machen. Ziel dieser Studie ist die Entwicklung eines reliablen und validen Assessmenttools zur Kohlenhydratschätzung und der Erfassung der Boluskalkulation (SAMRT), mit der in der klinischen Praxis überprüft werden kann, in wie weit dies ien Patient adäquat beherrscht. Methoden: Nach verschiedenen Voruntersuchungen wurden aus einem Itempool mittels einer Itemanalyse 28 Aufgaben extrahiert, welche die Fähigkeit der Kohlenhydratschätzung (12 Items) und zur Boluskalkulation (16 Items) abbilden. Die Aufgaben zur Kohlenhydratschätzung bestanden aus Abbildungen mit einfachen Nahrungsmitteln und komplexen Mahlzeiten. Die Fähigkeit zur Boluskakulation wurde mit Textaufgaben erfragt (Multiple Choice-Verfahren). Zur Erfassung der psychometrischen Qualität von SMART wurden Itemcharakteristika sowie die Reliabilität und Validität bestimmt. Ergebnisse: An dieser Studie nahmen 300 Diabetespatienten mit einer intensivierten Insulintherapie teil (Alter 43,0 ± 14,2J.; Diabetesdauer 16,7 ± 12,2J.; 51,3 1% männlich; 92% Typ 1 Diabetes; 35,1% mit CSII-Therapie). Die Gesamtskala von SMART wies mit einer mittleren Schwierigkeit von 57,3 ± 43% und einer mittleren Trennschärfe von rit = 0,37 gute Itemcharakteristika sowie eine hohe Reliabilität (Cronbach's α= 0,84) auf. Für die Validität von SMART spricht, dass Patienten mit einem höheren SMART Score einen signifikant niedrigeren HbA1c-Wert (r =-0,15; p = 0,01) sowie niedrigere prä- (r =-0,21; p < 0,01) und postprandiale (r =-0,17; p < 0,01) Blutzuckerwerte aufwiesen. Außerdem hatten Teilnehmer mit einer geringeren Schulbildung einen signifikant geringeren SMART Score (14,9 ± 5,1 vs. 17,9 ± 5,3; p < 0,01) als Personen mit einem höheren Bildungsstand (Abitur oder Hochschulabschluss). Patienten mit einer CSII-Therapie wiesen zudem einen höheren SMART-Score auf als Patienten mit einer multiplen Insulininjektionstherapie (15,5 ± 5,3 vs. 17,1 ± 4,9 p = 0,018). Schlussfolgerung: Die Untersuchung der psychometrischen Qualität von SMART zeigte, dass es gelungen ist, ein valides und reliables Assessmenttool zur Erfassung von Fertigkeiten zur praktischen Durchführung einer intensivierten Insulintherapie zu entwickeln. Mithilfe von SMART kann ein potenzieller (Nach-) Schulungsbedarf bei Patienten (z.B. KE/BE-Schätztraining) erhoben werden. Ebenso können mithilfe des SMART aber auch Patienten identifiziert werden, für die der Einsatz eines Boluskalkulators sinnvoll sein könnte

Fragebogen zur Zufriedenheit von Ärzten mit der Diabetestherapie

Fragestellung: Bisher existieren zwar Erhebungsinstrumente zur Patientenzufriedenheit, jedoch bislang noch kein Fragebogen zur Erfassung der Zufriedenheit von Ärzten mit der Diabetestherapie. In dieser Studie wurde daher ein Fragebogen entwickelt und psychometrisch evaluiert, der die Zufriedenheit des Arztes mit der Diabetestherapie (Zufr-DT) und der Analyse und Besprechung der Blutzuckerwerte (Zufr-BZ) erfasst. Methodik: Ein Itempool (Zufr-DT, Zufr-BZ) wurde generiert und von 188 Diabetologen und Ärzten aus Deutschland beantwortet. Ergebnisse: Die Zufr-DT-Skala enthält 13 Items und erreicht ein Cronbachs Alpha von α= 0,93 mit einer mittleren Trennschärfe von r = 0,71. Die Zufr-BZ-Skala enthält 10 Items mit einem Cronbachs Alpha von α= 0,92 und einer mittleren Trennschärfe von r = 0,73. Die Korrelation der beiden Skalen beträgt r = 0,63 (p < 0,05). Faktorenanalytisch kann die Zufr-DT-Skala in zwei Unterfaktoren „Effekte der Diabetestherapie“ und „Aufwand und Nutzen“ unterteilt werden (65% Varianzaufklärung). Die Zufr-BZ-Skala konnte faktorenanalytisch in „Nutzung der Blutzuckerwerte“ und „Effektivität der Besprechung“ unterteilt werden (75,5% Varianzaufklärung). Eine höhere Zufriedenheit in beiden Skalen geht einher mit einer größeren Zufriedenheit mit der Tätigkeit als Arzt (Zufr-DT: r = 0,2, p < 0,05; Zufr-BZ: r = 0,32, p < 0,05), mit einer größeren Zufriedenheit mit dem Therapieergebnis (Zufr-DT: r = 0,34, p < 0,05; Zufr-BZ: r = 0,3, p < 0,05) und einer größeren Zufriedenheit mit dem Ergebnis der ärztlichen Tätigkeit (Zufr-DT: r = 0,27, p < 0,05; Zufr-BZ: r = 0,25, p < 0,05) Schlussfolgerungen: Mit den beiden Skalen stehen reliable und valide Instrumente zur Verfügung, um die Zufriedenheit der behandelten Ärzte zu erfassen. Mithilfe dieses Fragebogens kann zukünftig evaluiert werden, welchen Einfluss die Zufriedenheit des Arztes auf die weitere Therapie hat bzw. wodurch die Zufriedenheit des Arztes beeinflusst wird