Entwicklung lentiviraler Vektoren für die B-zellspezifische Expression von Transgenen in vivo

Der Transfer von Genen ist eine unverzichtbare Methode für die Erforschung von Genfunktionen in vivo, für die gezielte Expression von Proteinen oder RNA-Molekülen, sowie für die Entwicklung von Gentherapien z.B. gegen Krebserkrankungen oder genetische Defekte. Gerade unter gentherapeutischen Gesichtspunkten sind virale Gentransfervektoren von Interesse, mit deren Hilfe beispielsweise fehlende bzw. eingeschränkte Genfunktionen wiederhergestellt werden können. Ebenso vorstellbar ist der Einsatz viraler Vektoren für Immunisierungen, die z.B. zur Auslösung tumorspezifischer zellulärer Immunantworten führen. Wünschenswert ist in diesem Zusammenhang besonders eine zellspezifische Expression von Transgenen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden deshalb lentivirale Vektoren entwickelt, mit deren Hilfe eine konstitutive Genexpression in B-Zellen ermöglicht wurde. Die Beschränkung der Genexpression auf B-Zellen wurde durch die Wahl eines entsprechenden zellspezifischen Promotors gewährleistet. Lentivirale Vektoren haben sich in jüngster Zeit zu interessanten Werkzeugen für die Gentherapie sowie zu vielversprechenden Vakzinkandidaten entwickelt. Mit Hilfe dieser Gentransfervektoren können zahlreiche verschiedene Zelltypen, darunter auch hämatopoetische Zellen einschließlich der Immunzellen, in vitro und in vivo transduziert werden, wobei die Spezifität der Antigenexpression auf der Wahl eines entsprechenden Promotors beruht. Als Transgene wurden das verbesserte grün-fluoreszierende Protein eGFP (enhanced green fluorescent protein; im Folgenden als „GFP“ bezeichnet) und das Hühnerei-Albumin (im Folgenden als „OVA“ bezeichnet) exprimiert. Anhand umfangreicher Analysen der GFP-Expression in Knochenmarkschimären konnte die B-Zellspezifität der generierten Vektoren überprüft werden. Desweiteren wurden die lentiviralen Vektoren auch systemisch (intravenös) angewandt. Hier konnte gezeigt werden, dass die Spezifität der Genexpression mit dieser Applikationsroute erhalten bleibt, wohingegen die Expressionsstärke im Vergleich zu den Chimären erheblich zurückgeht. Funktionelle Studien mit B-zellspezifischen, OVA-kodierenden lentiviralen Vektoren konnten jedoch belegen, dass die Expressionsstärke nach systemischer Anwendung noch ausreichend war, um eine OVA-spezifische zelluläre Immunität zu stimulieren. Damit erwies sich das System auch hinsichtlich möglicher therapeutischer Anwendungen, z.B. als Vakzine, als funktionell. Eine humorale Antikörperantwort gegen virale Hüllproteine bzw. gegen OVA konnte nicht nachgewiesen werden. Zusammenfassend belegen diese Daten, dass die systemische Anwendung B-zellspezifischer lentiviraler Vektoren möglich ist und einen interessanten Ansatz zur Generierung neuer Vakzine bieten kann. Denkbar wäre beispielsweise eine Anwendung bei der Unterstützung therapeutischer Vakzinierungen. Ein weiterer interessanter Aspekt in diesem Zusammenhang ist die Rolle der B-Zelle als antigenpräsentierende Zelle, die mit Hilfe einer temporären Kontrolle der Genexpression genauer untersucht werden könnte. Aus diesem Grunde wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit auch ein induzierbares gammaretrovirales Genexpressionssystem entwickelt, um ein gezieltes An- und Abschalten der Genexpression in B-Zellen zu erreichen. Die Beschränkung auf B-Zellen wurde hier ebenfalls durch die Wahl eines entsprechenden zellspezifischen Promotors gewährleistet. Detaillierte in vivo-Analysen des Expressionssystems in Knochenmarkschimären zeigten jedoch, dass es einerseits nach Induktion nur zu einer schwachen Transgenexpression kam und es andererseits eine unerwünschte Hintergrundexpression sowohl in B-Zellen als auch in Nicht-B-Zellen gab. Aus diesen Gründen musste von der Anwendung dieses Systems für geplante Studien zur Rolle der Genexpression während verschiedener Stadien der B-Zellentwicklung abgesehen werden

Immunogenicity and safety of three consecutive production lots of the non replicating smallpox vaccine MVA: A randomised, double blind, placebo controlled phase III trial

<div><p>Background</p><p>Modified Vaccinia Ankara (MVA) is a live, viral vaccine under advanced development as a non-replicating smallpox vaccine. A randomised, double-blind, placebo-controlled phase III clinical trial was conducted to demonstrate the humoral immunogenic equivalence of three consecutively manufactured MVA production lots, and to confirm the safety and tolerability of MVA focusing on cardiac readouts.</p><p>Methods</p><p>The trial was conducted at 34 sites in the US. Vaccinia-naïve adults aged 18-40 years were randomly allocated to one of four groups using a 1:1:1:1 randomization scheme. Subjects received either two MVA injections from three consecutive lots (Groups 1-3), or two placebo injections (Group 4), four weeks apart. Everyone except personnel involved in vaccine handling and administration was blinded to treatment. Safety assessment focused on cardiac monitoring throughout the trial. Vaccinia-specific antibody titers were measured using a Plaque Reduction Neutralization Test (PRNT) and an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). The primary immunogenicity endpoint was Geometric Mean Titers (GMTs) after two MVA vaccinations measured by PRNT at trial visit 4. This trial is registered with ClinicalTrials.gov, number NCT01144637.</p><p>Results</p><p>Between March 2013 and May 2014, 4005 subjects were enrolled and received at least one injection of MVA (n = 3003) or placebo (n = 1002). The three MVA lots induced equivalent antibody titers two weeks after the second vaccination, with seroconversion rates of 99·8% (PRNT) and 99·7% (ELISA). Overall, 180 (6·0%) subjects receiving MVA and 29 (2·9%) subjects in the placebo group reported at least one unsolicited Adverse Event (AE) that was considered trial-related. Vaccination was well tolerated without significant safety concerns, particularly regarding cardiac assessment.</p><p>Conclusions</p><p>The neutralizing and total antibody titers induced by each of the three lots were equivalent. No significant safety concerns emerged in this healthy trial population, especially regarding cardiac safety, thus confirming the excellent safety and tolerability profile of MVA.</p><p>Trial registration</p><p>ClinicalTrials.gov <a href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01144637" target="_blank">NCT01144637</a></p></div

Adverse events of special interest (FAS, n = 4005).

<p>Adverse events of special interest (FAS, n = 4005).</p

Subject disposition.

<p>FAS = full analysis set; IAS = Immunogenicity Analysis Set, subset used for immunogenicity analysis (first ~ 700 subjects enrolled per group); PPS = per protocol set; n = number of subjects in the specified category.</p

Demographic data (FAS, n = 4005).

<p>Demographic data (FAS, n = 4005).</p

PRNT and ELISA GMTs, seroconversion rates and GMT group ratios 2 weeks after the second vaccination (PPS, n = 2549).

<p>PRNT and ELISA GMTs, seroconversion rates and GMT group ratios 2 weeks after the second vaccination (PPS, n = 2549).</p