DETECTION OF CALR MUTATIONS USING HIGH RESOLUTION MELTING CURVE ANALYSIS (HRM-A); APPLICATION ON A LARGE COHORT OF GREEK ET AND MF PATIENTS

Background and Objectives Somatic mutations in the calreticulin gene (CALR) are detected in approximately 70% of patients with essential thrombocythemia (ET) and primary or secondary myelofibosis (MF), lacking the JAK2and MPLmutations. To determine the prevalence of CALRframeshift mutations in a population of MPN patients of Greek origin, we developed a rapid low-budget PCR-based assay and screened samples from 5 tertiary Haematology units. This is a first of its kind report of the Greek patient population that also disclosed novel CALRmutants.   Methods MPN patient samples were collected from different clinical units and screened for JAK2and MPLmutations after informed consent was obtained. Negative samples were analyzed for the presence of CALRmutations. To this end, we developed a modified post Real Time PCR High Resolution Melting Curve analysis (HRM-A) protocol. Samples were subsequently confirmed by Sanger sequencing.   Results Using this protocol we screened 173 MPN, JAK2and MPLmutation negative, patients of Greek origin, of whom 117 (67.63%) displayed a CALRexon 9 mutation. More specifically, mutations were detected in 90 out of 130 (69.23%) essential thrombocythaemia cases (ET), in 18 out of 33 (54.55%) primary myelofibrosis patients (pMF) and in 9 out of 10 (90%) cases of myelofibrosis secondary to ET (post-ET sMF). False positive results were not detected. The limit of detection (LoD) of our protocol was 2%. Furthermore, our study reavealed 6 rare novel mutations which are to be added in the COSMIC database.    Conclusions Overall, our method could rapidly and cost-effectively detect the mutation status in a representative cohort of Greek patients; the mutation make-up in our group was not different from what has been published for other national groups

Ο ρόλος του ινωδογόνου στη θρόμβωση

Το ινωδογόνο είναι μια πρωτεΐνη, ευρισκόμενη σε αφθονία στο πλάσμα, που διαδραματίζει κομβικό ρόλο στην πρωτογενή και δευτερογενή αιμόσταση. Υπό τη δράση της θρομβίνης πολυμερίζεται ταχύτατα, δημιουργώντας ένα μη διαλυτό τρισδιάστατο δίκτυο ινικής. Σε αυτό ενσωματώνονται διερχόμενα κυτταρικά στοιχεία, πρωτίστως αιμοπετάλια, ερυθρά αλλά και λευκά αιμοσφαίρια. Η δομική σταθερότητα του δικτύου ενισχύεται περαιτέρω με τη δράση του ενεργοποιημένου παράγοντα XIII (XIIIa) που λειτουργεί ως τρανσγλουταμινάση. Η φυσική ιστορία του δημιουργούμενου θρόμβου, αφού εξυπηρετήσει την αιμόσταση, περιλαμβάνει λύση από το ινωδολυτικό σύστημα, ώστε να αποκατασταθεί η βατότητα του αγγείου. Η δημιουργία θρόμβου, αιτιολογημένη ή μη, που δεν καταλήγει να υποστεί λύση και παρακωλύει την ενδοαγγειακή κυκλοφορία ονομάζεται θρόμβωση. Ποσοτικές και ποιοτικές κληρονομικές διαταραχές του ινωδογόνου, πολυμορφισμοί που οδηγούν σε αυξημένα επίπεδα στο πλάσμα ή τροποποιούν τη λειτουργικότητα του μορίου, το ινωδογόνο γ΄, προϊόν εναλλακτικής συρραφής της γ-αλυσίδας (γ΄), αλλά και μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις, όπως απαντώνται σε μια σειρά επίκτητων διαταραχών, όλα έχουν συσχετιστεί με θρομβωτική διάθεση. Επίσης, πρόσφατα, οι έρευνες επικεντρώνονται στις ιξωδοελαστικές (viscoelastic) ιδιότητες της ινικής, σχετικά με το ρόλο τους στον καθορισμό του θρομβωτικού κινδύνου. Θρόμβοι αποτελούμενοι από πυκνό δίκτυο ανθίστανται στη δράση του ινωδολυτικού συστήματος και έχουν επανειλημμένα συσχετιστεί με θρόμβωση. O σχηματισμός, η δομή και η σταθερότητα της ινικής επηρεάζονται από πολλούς παράγοντες, μεταξύ των οποίων καθοριστικής σημασίας είναι το ινωδογόνο, ως ακρογωνιαίος δομικός λίθος του σχηματιζόμενου θρόμβου. Σκοπός της μελέτης είναι να παρουσιάσει τα πρόσφατα δεδομένα σχετικά με τη δράση του ινωδογόνου στην παθοφυσιολογία της θρόμβωσης, στηριζόμενη σε ανασκόπηση της σύγχρονης βιβλιογραφίας.Fibrinogen is an abundant plasma protein that displays a crucial role for both primary and secondary hemostasis. In the presence of thrombin, fibrinogen is converted to fibrin, generating an insoluble tridimensional network, enriched by trapped passing cells, mostly platelets, white and red cells. The network is further stabilized by the action of factor XIIIa, a member of the transglutaminase family of proteins. The natural history of thrombus is a dynamic process: after prevention of blood loss, which comprises it’s main purpose, it has to be dissolved by the fibrinolytic system. Otherwise, it obstructs blood flow leading to thrombosis. Inherited fibrinogen disorders, polymorphisms increasing plasma protein levels or modifying functionality, fibrinogen γ΄, a splice variant of γ-chain, as well as posttranslational modifications, found in many acquired disorders, have all been related to thrombotic tendency. Recently, the viscoelastic properties of fibrin clot are also linked to thrombosis. Clots that have high fiber density and increased resistance to fibrinolysis have been consistently associated with risk of thrombosis. Fibrinogen provides the main building blocks for the clot, underscoring it’s vital role in the formation, overall structure and stability of fibrin network. This study provides recent data supporting a role for fibrinogen in the pathogenesis of thrombotic disease