The Conserved Candida albicans CA3427 Gene Product Defines a New Family of Proteins Exhibiting the Generic Periplasmic Binding Protein Structural Fold

Nosocomial diseases due to Candida albicans infections are in constant rise in hospitals, where they cause serious complications to already fragile intensive care patients. Antifungal drug resistance is fast becoming a serious issue due to the emergence of strains resistant to currently available antifungal agents. Thus the urgency to identify new potential protein targets, the function and structure of which may guide the development of new antifungal drugs. In this context, we initiated a comparative genomics study in search of promising protein coding genes among the most conserved ones in reference fungal genomes. The CA3427 gene was selected on the basis of its presence among pathogenic fungi contrasting with its absence in the non pathogenic Saccharomyces cerevisiae. We report the crystal 3D-structure of the Candida albicans CA3427 protein at 2.1 Å resolution. The combined analysis of its sequence and structure reveals a structural fold originally associated with periplasmic binding proteins. The CA3427 structure highlights a binding site located between the two protein domains, corresponding to a sequence segment conserved among fungi. Two crystal forms of CA3427 were found, suggesting that the presence or absence of a ligand at the proposed binding site might trigger a “Venus flytrap” motion, coupled to the previously described activity of bacterial periplasmic binding proteins. The conserved binding site defines a new subfamily of periplasmic binding proteins also found in many bacteria of the bacteroidetes division, in a choanoflagellate (a free-living unicellular and colonial flagellate eukaryote) and in a placozoan (the closest multicellular relative of animals). A phylogenetic analysis suggests that this gene family originated in bacteria before its horizontal transfer to an ancestral eukaryote prior to the radiation of fungi. It was then lost by the Saccharomycetales which include Saccharomyces cerevisiae

Le TIMP-1 humain, une protéine multifacette (production sous forme recombinante et intérêt thérapeutique)

Les TIMPs (Tissue Inhibitor of Metalloprokinases) sont lès inhihiteurs spécifiques des métalloprokases matricielles (MMPs). Ils participent à la regulation du remodelage matriciel, mais présentent aussi des fonctions indépendantes de cette activité (facteur de croissance, facteur de survie). A travers ces multiples facettes, la protéine TIMP-1 est impliquée dans des processus phvsiologiques et pathologiques. Nos objectifs sont de caractériser et d'utiliser les propriétés biochimiques de TIMP-1 afin d'évaluer son potentiel thérapeutique. Nous avons établi un protocole d'expression en système mammifère puis un schéma de purification de la protéine rh-TIMP-1 (recombinant human TIMP-1) nous permettant d'obtenir 30 mg/l de TlMP-1 pure, dépassant largement les taux dejà décrits. Ceci nous a permis d'évaluer son efficacité en tant qu'agent thérapeutique dans un modèle murin d'arthrite au collagène (mimant la polyarthrite rhumatoïde). Des analvses cliniques et sérologiques suggèrent un effet bénéfique des injections de rh-TIMP-1 à dose élevée contrairement aux doses faibles. Des investigations supplémentaires sont nécessaires pour déterminer le réel effet de TIMP-1. En parallèle, nous avons étudié la propriété de transduction de TIMP-1 dans les cellules tumorales. Nous avons montré que les acides aminés C-terminaux portent cette propriété et désormais nous devons optimiser ce processus et tester le transport d'une protéine thérapeutique (p.53). Ce travail confirme l'intérêt biotechnologique de la proteine TIMP-1 en tant que navette et suggère l'intérêt thérapeutique potentiel qui nécessite des investigations additionnelles en particulier dans d'autres modèles pathologiques.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF

Le TIMP-1 humain, une protéine multifacette (production sous forme recombinante et intérêt thérapeutique)

Les TIMPs (Tissue Inhibitor of Metalloprokinases) sont lès inhihiteurs spécifiques des métalloprokases matricielles (MMPs). Ils participent à la regulation du remodelage matriciel, mais présentent aussi des fonctions indépendantes de cette activité (facteur de croissance, facteur de survie). A travers ces multiples facettes, la protéine TIMP-1 est impliquée dans des processus phvsiologiques et pathologiques. Nos objectifs sont de caractériser et d'utiliser les propriétés biochimiques de TIMP-1 afin d'évaluer son potentiel thérapeutique. Nous avons établi un protocole d'expression en système mammifère puis un schéma de purification de la protéine rh-TIMP-1 (recombinant human TIMP-1) nous permettant d'obtenir 30 mg/l de TlMP-1 pure, dépassant largement les taux dejà décrits. Ceci nous a permis d'évaluer son efficacité en tant qu'agent thérapeutique dans un modèle murin d'arthrite au collagène (mimant la polyarthrite rhumatoïde). Des analvses cliniques et sérologiques suggèrent un effet bénéfique des injections de rh-TIMP-1 à dose élevée contrairement aux doses faibles. Des investigations supplémentaires sont nécessaires pour déterminer le réel effet de TIMP-1. En parallèle, nous avons étudié la propriété de transduction de TIMP-1 dans les cellules tumorales. Nous avons montré que les acides aminés C-terminaux portent cette propriété et désormais nous devons optimiser ce processus et tester le transport d'une protéine thérapeutique (p.53). Ce travail confirme l'intérêt biotechnologique de la proteine TIMP-1 en tant que navette et suggère l'intérêt thérapeutique potentiel qui nécessite des investigations additionnelles en particulier dans d'autres modèles pathologiques.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF

Use of a designed fusion protein dissociates allosteric properties from the dodecameric state of Pseudomonas aeruginosa catabolic ornithine carbamoyltransferase

The catabolic ornithine carbamoyltransferase from Pseudomonas aeruginosa, an enzyme consisting of 12 identical 38-kDa subunits, displays allosteric properties, namely carbamoylphosphate homotropic cooperativity and heterotropic activation by AMP and other nucleoside mono-phosphates and inhibition by polyamines. To shed light on the effect of the oligomeric organization on the enzyme's activity and/or allosteric behavior, a hybrid ornithine carbamoyl-transferase/glutathione S-transferase (OTCase-GST) molecule was constructed by fusing the 3' end of the P. aeruginosa arcB gene (OTCase) to the 5' end of the cDNA encoding Musca domestica GST by using a polyglycine encoding sequence as a linker. The fusion protein was overexpressed in Escherichia coli and purified from cell extracts by affinity chromatography, making use of the GST domain. It was found to exist as a trimer and to retain both the homotropic and heterotropic characteristic interactions of the wild-type catabolic OTCase but to a lower extent as compared with the wild-type OTCase. The dodecameric, organization of catabolic P. aeruginosa OT-Case may therefore be related to an enhancement of the substrate cooperativity already present in its trimers (and perhaps also to the thermostability of the enzyme).SCOPUS: ar.jinfo:eu-repo/semantics/publishe

Recombinant Nox4 cytosolic domain produced by a cell or cell-free base systems exhibits constitutive diaphorase activity

The membrane protein NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) oxidase Nox4 constitutively generates reactive oxygen species differing from other NADPH oxidases activity, particularly in Nox2 which needs a stimulus to be active. Although the precise mechanism of production of reactive oxygen species by Nox2 is well characterized, the electronic transfer throughout Nox4 remains unclear. Our study aims to investigate the initial electronic transfer step (diaphorase activity) of the cytosolic tail of Nox4. For this purpose, we developed two different approaches to produce soluble and active truncated Nox4 proteins. We synthesized soluble recombinant proteins either by in vitro translation or by bacteria induction. While proteins obtained by bacteria induction demonstrate an activity of 4.4 ± 1.7. nmol/min/nmol when measured against iodonitro tetrazolium chloride and 20.5 ± 2.8. nmol/min/nmol with cytochrome c, the soluble proteins produced by cell-free expression system exhibit a diaphorase activity with a turn-over of 26 ± 2.6. nmol/min/nmol when measured against iodonitro tetrazolium chloride and 48 ± 20.2. nmol/min/nmol with cytochrome c. Furthermore, the activity of the soluble proteins is constitutive and does not need any stimulus. We also show that the cytosolic tail of the isoform Nox4B lacking the first NADPH binding site is unable to demonstrate any diaphorase activity pointing out the importance of this domain. © 2012 Elsevier Inc.