The role of Notch signaling in thymic epithelium development

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011The thymus generates central immune tolerance by producing self-restricted and self-tolerant T-cells as a result of interactions between developing thymocytes and thymic epithelial cells (TECs). While the functional importance of TECs is well established, the mechanisms that direct their embryonic development are unclear. The Notch pathway is a major signaling pathway involved in cell-fate determination. Recently, H. Neves group observed that, during chicken embryogenesis, Notch signaling-related molecules are expressed in the endoderm of the pharyngeal pouches, prior to their specification into TECs, suggesting the involvement of Notch signaling in this process. In this work we aimed to study the role of Notch signaling in early stages of thymic development in chicken. To modulate Notch signaling in vivo, two new plasmids were generated with either the constitutively active form of Notch1 (intracellular domain of Notch1, ICN1) (pT2K-ICN1eGFP), or the dominant-negative (DN) form of Mastermind-like1 (MAML1) (transcriptional co-activator Notch signaling) (pT2K-DNMAML1eGFP). pT2K-ICN1eGFP and pT2K-DNMAML1eGFP were integrated in a “Tol2-mediated gene transfer” and “Tet-On” combined system of vectors developed by Y. Takahashi and collaborators, allowing the study of gain- and loss-of-function of Notch signaling, respectively. Our results show that pT2K-DNMAML1eGFP plasmid in this system, is capable of blocking Notch signaling. Conversely, further assays are required to confirm the functionality of pT2K-ICN1eGFP plasmid. Future studies of gain- and loss-of-function of Notch signaling in early thymic development will be performed by the genetic modification of isolated endodermal tissues of the presumptive territory of TECs with this system. The manipulated tissues will then be grafted into the body wall of a chicken embryo and thymic development followed by in situ observation. In vitro assays of pharyngeal region explants of E3.5 and E4 chicken embryos were performed to study the effect of Notch signaling inhibition during epithelial-mesenchymal interactions in early thymic development. Thymus and parathyroid glands development was assessed by Foxn1 and Gcm2 expression, respectively. We observed that Notch signaling inhibition by a γ-Secretase inhibitor (DAPT) interferes in Foxn1 expression in an apparent random fashion, making inconclusive its role in early thymic development. On the other hand, Gcm2 expression is down-regulated when Notch signaling is inhibited. This data suggests that Notch signaling is required in early stages of parathyroid development. Further studies are essential to unravel the role of Notch signaling in early thymic development.O timo gera tolerância imunitária ao produzir células-T “auto-restritas” e “auto-tolerantes”, cuja geração depende das interacções das suas células precursoras, os timócitos, com células especializadas do nicho tímico, as células epiteliais tímicas (CET). Embora a importância funcional das CET esteja bem estabelecida, os mecanismos moleculares responsáveis pelo seu desenvolvimento embrionário são ainda desconhecidos. O desenvolvimento do timo é acompanhado de perto pelo desenvolvimento das glândulas paratireóides. Os domínios presuntivos do timo e das glândulas paratireóides foram identificados na endoderme da 3ª e 4ª bolsas faríngicas pela expressão de Foxn1 e Gcm2, respectivamente. A especificação das CET depende de interacções entre a endoderme da 3ª e 4ª bolsas faríngicas e o mesênquima circundante - interacções epitélio-mesenquimais. Algumas destas interacções epitélio-mesenquimais começam agora a ser reveladas, nomeadamente através do trabalho do grupo de H. Neves, que demonstra que factores de transcrição como o Bmp4 e o Fgf10 são expressos sequencialmente no mesênquima e são essenciais para a especificação da endoderme da 3ª e 4ª bolsas faríngicas em CET. Outras vias de sinalização têm sido sugeridas como prováveis intervenientes neste processo. A sinalização Notch é uma delas, sendo uma via altamente conservada no reino animal, envolvida nos processos de decisão do destino celular, no desenvolvimento embrionário e no adulto. Esta via de sinalização regula vários processos biológicos, incluindo a hematopoiese, miogénese, neurogénese, vasculogénese, desenvolvimento da pele e outros processos de organogénese. Em 2001, o grupo de L. Parreira descreveu pela primeira vez, num contexto de um nicho estromal, a importância da formação de um microambiente Notch para a correcta especificação de progenitores hematopoiéticos nas diferentes linhagens linfóides. Este e outros grupos também observaram que os genes envolvidos na sinalização Notch são expressos de forma distinta nos diferentes territórios do timo adulto, reforçando a importância desta via de sinalização na função do mesmo. Recentemente, o grupo de H. Neves também observou, em embriões de galinha, que os genes envolvidos na sinalização Notch (receptores, ligandos e genes-alvo) estão diferencialmente expressos na endoderme das bolsas faríngicas, em estádios prévios à formação do rudimento tímico. Também observaram, usando um novo sistema in vitro de associações heteroespecíficas de tecidos embrionários, que a sinalização Notch interfere com a expressão normal de Foxn1 (marcador de CET) na endoderme das bolsas faríngicas. Este sistema de cultura permite uma análise funcional das moléculas envolvidas nas interacções epitélio-mesenquimais e também determinar a dinâmica temporal destas moléculas durante o desenvolvimento do timo. Este sistema recapitula in vitro os acontecimentos precoces do desenvolvimento tímico in vivo, uma vez que, quando enxertadas na membrana corioalantóide do embrião de galinha, estas associações de tecidos desenvolvem um timo funcional. Estes dados sugerem que a sinalização Notch está envolvida na especificação da endoderme das bolsas faríngicas em epitélio tímico. Neste projecto, tivemos como objectivo estudar a sinalização Notch na especificação da endoderme das bolsas faríngicas em epitélio tímico. Para isso, desenvolvemos estratégias in vivo e in vitro de ganho e perda-de-função da sinalização Notch em embriões de galinha. Para a abordagem in vivo, dois plasmídeos novos foram construídos, para expressar a forma constitutivamente activa de Notch1 (domínio intracelular de Notch1, ICN1) (pT2K-ICN1eGFP) ou a forma dominante-negativa de Mastermind-like1 (MAML1) (co-activador transcricional de sinalização Notch) (DNMAML1) (pT2K-DNMAML1eGFP). Estes plasmídeos foram integrados num sistema de vectores desenvolvido por Y. Takahashi e colaboradores, que combina a “transferência génica mediada por Tol2” e a “expressão condicional dependente de tetraciclina”. Assim, este sistema de vectores oferece uma abordagem experimental única para uma análise temporal, e específica de tecido, dos efeitos de ganho e perda-de-função da sinalização Notch durante a especificação/diferenciação das CET. Para realizar esses estudos, células endodérmicas do território gerador do epitélio tímico serão modificadas geneticamente com os plasmídeos pT2K-ICN1eGFP ou pT2K-DNMAML1eGFP (neste sistema de vectores) para activar ou bloquear a sinalização Notch, respectivamente, e serão enxertadas na parede do embrião de galinha, para acompanhar in situ o desenvolvimento do timo quimérico. Os nossos resultados mostram que o plasmídeo que expressa a forma DNMAML1, pT2K-DNMAML1eGFP, neste sistema de vectores, tem a capacidade de inibir a sinalização Notch. O trabalho poderá assim prosseguir para os estudos de perda-de-função da sinalização Notch na endoderme das bolsas faríngicas, antes da sua especificação em CET. Por outro lado, o plasmídeo que expressa o ICN1, pT2K-ICN1eGFP, neste sistema de vectores, necessita de mais experimentação para comprovar a sua funcionalidade. A abordagem in vitro consistiu na realização de ensaios de cultura de explantes da região faríngica de embriões de galinha com 3.5 e 4 dias de desenvolvimento para estudar o efeito da inibição farmacológica da sinalização Notch (com um inibidor da γ-Secretase – DAPT) durante as interacções epitélio-mesenquimais no desenvolvimento inicial do timo. Tanto a especificação da endoderme faríngica em epitélio tímico como a manutenção do domínio das glândulas paratireóides nos explantes em cultura foram avaliadas através da expressão in situ de Foxn1 e Gcm2, respectivamente. Os nossos ensaios in vitro revelaram que a inibição da sinalização Notch, em fases iniciais do desenvolvimento tímico, interfere com a expressão de Foxn1 de forma aparentemente aleatória, mostrando elevada heterogeneidade de resultados. Assim, o papel da sinalização Notch em fases iniciais do desenvolvimento do timo continua por precisar. Por outro lado, a expressão de Gcm2 é bloqueada com a inibição da sinalização Notch nessas mesmas fases de desenvolvimento. Portanto, os nossos dados in vitro sugerem um papel da sinalização Notch no desenvolvimento das glândulas paratireóides, pelo menos em fases iniciais do desenvolvimento. Novas experiências in vitro usando explantes da região faríngica de embriões de galinha em estádios de desenvolvimento diferentes (tanto mais precoces como mais tardios) daqueles estudados, e a realização dos estudos in vivo com o nosso sistema de vectores, serão essenciais para compreender estes resultados e também para estudar o papel da sinalização Notch na especificação/desenvolvimento das CET. Com este projecto esperamos contribuir para o conhecimento do papel da sinalização Notch no desenvolvimento normal das células epiteliais tímicas, um passo fundamental na compreensão dos eventos responsáveis pela manutenção de um timo saudável ao longo da vida e pela reparação da sua função em situações patológicas. Mais, o conhecimento de elementos chave envolvidos na especificação das CET poderá no futuro permitir a criação de novos sistemas in vitro para gerar células epiteliais tímicas, as quais, por sua vez, poderão abrir novas possibilidades de produção in vitro de repertórios de células-T e novas oportunidades para restaurar a função tímica em indivíduos atímicos ou imunodeficientes e, também, melhorar as terapias de transplantação de órgãos