Einfluss der Proteolyse auf Virus-assoziierte entzündliche Herzmuskelerkrankungen

Proteolysis, facilitated through activity of the proteasome – a multi-enzymatic complex – has numerous important purposes within a cells' protein homeostasis. The proteolytic machinery regulates antigen presentation, the activity of intracellular pathways, protein quality control and cell cycle signaling. An isoform, predominantly expressed in immune cells and thus called the immunoproteasome can be targeted by genetic knockout or application of a specific inhibitor, such as ONX 0914, rendering it dysfunctional. The immunoproteasomes' role has long been investigated in mouse models for cardiac inflammatory disease, as it is abundantly expressed in infiltrating immune cells as well as strongly upregulated in inflamed cardiomyocytes. While this isoform is expressed in aid of keeping a cells' protein balance intact under conditions of increased cellular stress, mouse models with a genetically predisposed background who develop acute viral myocarditis are prone to overwhelming inflammation and subsequent cardiac tissue damage, calling into question whether the inflammatory response is helpful or rather detrimental. Here, mice are infected with Coxsackievirus B3 (CVB3) in a model that is well characterized for CVB3-induced acute and chronic viral myocarditis. Treatment with ONX 0914 or its vehicle only, allows a closer look at inflammatory processes and their dependence the immunoproteasome. Previously, we found that CVB3-myocarditis can be significantly mitigated in mice receiving ONX 0914, improving overall survival and dampening the height of inflammatory response to the infection. In this project, our objective was to follow up on the preventative and therapeutic capacity for ONX 0914, investigating a possible mitigating effect on viral cardiac inflammatory disease. We aimed to distinguish further the role of immunoproteasome-specific inhibition during both acute and chronic stages of the disease. Flow cytometric and qPCR analysis of heart and spleen tissue as well as blood work for markers of cardiomyocyte death revealed that mice experienced higher viral burden, increased viral cytotoxicity and enhanced levels of infiltrating immune cells if their immunoproteasome function was inhibited before infection. This indicated a positive effect for sustained rather than impaired immunoproteasome function in this model for CVB3-myocarditis and prompted further inquiry into ONX 0914's inhibitory capacity and efficacy on the level of protein expression of the immunoproteasomes subunits. Interestingly, in experiments where the immunoproteasome was inhibited after mice had already been infected with CVB3, we found no harmful effect of treatment with ONX 0914 compared to the vehicle in this mouse model, indicating that the immunoproteasomes key role during viral inflammation lies in the early stages of immune response and calling into question whether immunoproteasome-inhibition might enhance other pro-inflammatory compensating mechanisms.Proteolyse ist ein intrazellulärer Prozess, der durch die Aktivität des Proteasoms – eines multienzymatischen Komplexes – zur Aufrechterhaltung der intrazellulären Proteinhomöostase beiträgt und von dem zahlreiche Vorgänge abhängig sind. So werden Antigenpräsentation, intrazelluläre Kommunikationswege, Proteinqualitätskontrollen sowie Signale im Zellzyklus über die Funktionalität des Proteasoms reguliert. Die Bildung einer Proteasomisoform, die überwiegend in Immunzellen exprimiert wird, des Immunoproteasoms (IP), kann durch genetisches Knockout oder einen spezifischen Inhibitor wie ONX 0914 blockiert werden. Da die Expression des IP im Rahmen entzündlicher Herzmuskelerkrankungen im Mausmodell in infiltrierenden Immunzellen wie auch Kardiomyozyten stark hochreguliert ist, eignen sich diese Modelle, um den Einfluss des IPs auf die Entzündungsreaktion zu untersuchen. Obwohl das IP exprimiert wird, um die Proteinhomöostase einer Zelle in Phasen vermehrten zellulären Stresses intakt zu halten, kann diese Regulierung zu einer überschießenden Immunantwort mit chronischer Inflammation führen, woraus sich die Frage ergibt, ob die durch das IP mitverantwortete Entzündungsreaktion hilfreich oder vielmehr schädlich ist. Wir infizierten Mäuse in einem Modell mit Coxsackievirus B3 (CVB3), das für die Untersuchung der akuten viralen Myokarditis gut charakterisiert ist. Eine Behandlung mit ONX 0914 oder dem Vehikel ermöglicht einen genaueren Blick auf entzündliche Prozesse und ihre Abhängigkeit vom IP. Zuvor konnten wir zeigen, dass die akute CVB3-Myokarditis bei Mäusen, die ONX 0914 erhalten, signifikant gemildert wird – sie weisen verbessertes Gesamtüberleben auf und das Niveau der Entzündungsreaktion war deutlich reduziert. Ziel dieses Projektes war, die präventiven und therapeutischen Möglichkeiten einer Hemmung der IP-Aktivität im Modell der CVB3-Myokarditis zu charakterisieren und eine schützende Wirkung sowohl im akuten als auch im chronischen Stadium der Krankheit zu untersuchen. Durchflusszytometrische und qPCR-Analysen von Herzund Milzgewebe sowie Blutuntersuchungen ergaben, dass Mäuse eine höhere Viruslast, höhere virale Zytotoxizität und eine erhöhte Menge an Herzmuskelinfiltrierenden Immunzellen aufwiesen, wenn ihre IP-Funktion vor der Infektion durch ONX 0914 gehemmt wurde. Dies deutete auf einen Vorteil einer aufrechterhaltenen im Gegensatz zur beeinträchtigten IP-Funktion in diesem Modell hin und veranlasste Untersuchungen der Wirksamkeit von ONX 0914 auf die Proteinexpression. Interessanterweise konnten wir in Experimenten, in denen das IP gehemmt wurde, nachdem Mäuse bereits mit CVB3 infiziert worden waren, keine schädliche Wirkung der Behandlung mit ONX 0914 nachweisen, was darauf hindeutet, dass die Schlüsselrolle des IPs während der Entzündungsreaktion in Frühstadien der Immunantwort liegt und die Frage aufwirft, ob eine Blockade des IPs andere proinflammatorische Kompensationsmechanismen verstärken könnte

ONX 0914 Lacks Selectivity for the Cardiac Immunoproteasome in CoxsackievirusB3 Myocarditis of NMRI Mice and Promotes Virus-Mediated Tissue Damage

Inhibition of proteasome function by small molecules is highly efficacious in cancer treatment. Other than non-selective proteasome inhibitors, immunoproteasome-specific inhibitors allow for specific targeting of the proteasome in immune cells and the profound anti-inflammatory potential of such compounds revealed implications for inflammatory scenarios. For pathogen-triggered inflammation, however, the efficacy of immunoproteasome inhibitors is controversial. In this study, we investigated how ONX 0914, an immunoproteasome-selective inhibitor, influences CoxsackievirusB3 infection in NMRI mice, resulting in the development of acute and chronic myocarditis, which is accompanied by formation of the immunoproteasome in heart tissue. In groups in which ONX 0914 treatment was initiated once viral cytotoxicity had emerged in the heart, ONX 0914 had no anti-inflammatory effect in the acute or chronic stages. ONX 0914 treatment initiated prior to infection, however, increased viral cytotoxicity in cardiomyocytes, promoting infiltration of myeloid immune cells into the heart. At this stage, ONX 0914 completely inhibited the β5 subunit of the standard cardiac proteasome and less efficiently blocked its immunoproteasome counterpart LMP7. In conclusion, ONX 0914 unselectively perturbs cardiac proteasome function in viral myocarditis of NMRI mice, reduces the capacity of the host to control the viral burden and promotes cardiac inflammation