Uso de una PCR anidada para el diagnóstico del virus de la necrosis pancreática infecciosa (VNPI) en truchas de campo

The isolation of the infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) in cell culture is currently the main diagnostic method. Although it is a reliable method, it is expensive, and the results take three weeks. This study aimed to establish and evaluate the use of a nested PCR (nPCR) for the rapid diagnosis of the IPNV, decreasing the diagnosis time and increasing its sensitivity. Therefore, two pairs of primers were designed based on Mexican sequences. The first pair (RT-PCR) amplified a 682 bp product, and the second pair (nPCR) 229 bp of the VP2 gene. Subsequently, 70 rainbow trout fry (Oncorhynchus mykiss) were infected with the virulent strain MEX3-CSM-05 at a dose of 1X105.8 TCID50/0.02 ml. From each organism, the kidney, spleen, pyloric caeca, liver, intestine, and gills were collected. To evaluate the tests, a total of 26 clinically healthy adult trouts from commercial farms in the State of Mexico were used.  The detection frequency of the  IPNV  using  RT-PCR was 87.1 % in gills, 61.4 % in liver, 61.4 % in pyloric caeca, 58.6 % in kidney, 35.7 % in the intestine, and 32.9 % in the spleen (P<0.05). RT-PCR negative samples were positive in the nPCR. Similarly, samples from the wild trout organs were positive. In conclusion, the RT-PCR was less sensitive than the nPCR, which showed a sensitivity of 100 %. Therefore, nPCR is the best option for a reliable diagnosis of the IPNV in infected and sick fish.El aislamiento en cultivo celular es el método principal para el diagnóstico del virus de la necrosis pancreática infecciosa (VNPI). Aunque es un método confiable, resulta costoso y conlleva tres semanas en proporcionar un resultado. Para disminuir el tiempo en el diagnóstico y aumentar la sensibilidad para la detección del VNPI, el objetivo del presente estudio fue establecer y evaluar el uso de una PCR anidada (PCRa) para un diagnóstico rápido del VNPI. Para ello, se diseñaron dos pares de iniciadores basados en secuencias mexicanas. El primer par (RT-PCR) amplificó un producto de 682 pb y el segundo par (PCRa) 229 pb del gen VP2. Posteriormente, se infectaron 70 crías de truchas arcoíris (Oncorhynchus mykiss) con la cepa virulenta MEX3-CSM-05 a una dosis de 1X105.8 DICC50%/0.02 ml. De cada organismo se colectó el riñón, el bazo, los sacos pilóricos, el hígado, el intestino y las branquias. Para evaluar las pruebas, se utilizaron 26 truchas adultas clínicamente sanas de granjas comerciales del Estado de México. La frecuencia de detección del VNPI mediante RT-PCR en las branquias fue de 87.1 %, en el hígado 61.4 %, en los sacos pilóricos 61.4 %, en el riñón 58.6%, en el intestino 35.7 % y en el bazo 32.9 % (P<0.05). Las muestras negativas a la RT-PCR resultaron positivas en la PCRa. Asimismo, se mostraron positivas las muestras de los órganos de las truchas de campo. En conclusión, la RT-PCR tuvo menor sensibilidad que la PCRa, la cual mostró una sensibilidad del 100%. Por lo tanto, la PCRa es mejor para un diagnóstico confiable del VNPI en peces infectados y enfermos