The effect of phosphocreatine on the distribution of different subunits of translation elongation factor 1 in gently permeabilized human fibroblasts

Highly effective permeabilization/translation system developed recently (Negrutskii et al. (1994) Proc. Natl Acad. Sci. USA 91, 964–968) was used to study the distribution of FITC-labeled a and S submits of translation elongation factor 1 in human fibroblasts. Somewhat granular fluorescent picture observed for the both proteins distribution during active protein synthesis may be indicative of putative protein synthesis compartments. Exogenous phosphocreatine, an absolutely required agent to support the protein synthesis in permeabilized cells, is shown to influence the EF-1α distribution, while not affecting the EF-1δ. Most of EF-1α under «low energy» condition is found in nucleus. Thus, the possibility of the functional change in EF-la distribution is demonstrated supporting the Idea about transient character of EF-1α involvement into «heavy» EF-1 complex.Фосфокреатин є абсолютно необхідним компонентом суміші для білкового синтезу у безклітинних системах та перме­абілізованих клітинах. Показано, шр під впливом фосфокреа­тину змінюється локалізація α-субодиниці фактора елонгації трансляції І у пермеабілізованих клітинах вищих еукаріот. У присутності фосфокреатину EF-la має дискретну локалі­ зацію в цитоплазмі, а за його відсутністю більшість EF-1α локалізовано у ядрі. Розподіл δ-субодиниці EF-1 не залежить від наявності фосфокреатину в складі суміші для пермеабілізаціїФосфокреатин абсолютно необходим для обеспечения белково­го синтеза в бесклеточных системах и в пермеабилизованных клетках. Показано, что локализация EF-1α в пермеабилизо­ванных клетках высших эукариот зависит от присутствия фосфокреатина. в среде. Распределение EF-1α в цитоплазме в присутствии фосфокреатина носит дискретный характер, тогда как этот белок обнаруживается преимущественно в ядре в отсутствие фосфокреатина. Локализация EF-1δ не зависит от наличия фосфокреатина в смеси для пермеабилизации

Transcriptional and post-transcriptional control of eEF1A2 expression during myoblast diffrerentiation

During postnatal development, the switch of the expression from isoform A1 to the isoform A2 of eukaryotic translation elongation factor (eEF1A) is observed in neuronal and muscle tissues. The switch of the expression is a vital fundamental process, as mutant mice, with the partial EEF1A2 deletion dies on the 28th day after birth. Mechanism of the inhibition of A1 and stimulation of A2 expression during the first days of postnatal development is unknown. The existence of potential miRNA binding sites in the 3’UTR of mRNAs encoding the isoforms assumes a post-transcriptional control of abovementioned phenomenon. Aim. To check the possibility of post-transcriptional regulation of the isoforms A1 and A2 expression during differentiation of the human immortalized myoblasts cell line LHCN. Methods. The level of gene expression was quantified by qPCR, the existence of post-transcriptional regulation was demonstrated with Dual-Luciferase® Reporter Assay. Results. Using immortalized human myoblasts cell line LHCN, the induction of isoform A2 of eEF1 during differentiation of myoblasts was shown. The existence of transcriptional and post-transcriptional control of the abovementioned process was confirmed. Downregulation of mir-661 and mir-744 that have binding sites in the 3’ UTR of EEF1A2 mRNA, during differentiation suggests a potential role of microRNAs in the eEF1A2 induction during myoblast differentiation. Conclusions. Induction of A2 isoform of eEF1 during differentiation of myoblasts occurs on transcriptional and post-transcriptional level. Keywords: eEF1A1, eEF1A2, immortalized human myoblasts LHCN, differentiation, microRNA.Abstract У процесі постнатального розвитку в нейрональній і м’язовій тканинах відбувається зміна ізоформи А1 фактора елонгації трансляції на ізоформу А2. Перемикання експресії ізоформ є життєво важливою подією, оскільки мутантні миші, що містять делецію EEF1A2, гинуть на 28-й день після народження. Механізми інгібування А1 і стимуляції А2 протягом перших днів постнатального розвитку невідомі. Наявність сайтів зв’язування мікроРНК у 3'-нетрансльованих послідовностях мРНК ізоформ фактора елонгації трансляції передбачає існування посттранскрипційного контролю даного процесу. Мета. Перевірити можливість посттранскрипційної регуляції експресії ізоформ А1 і А2 під час диференціації імморталізованих міобластів людини LHCN. Методи. Рівень експресії генів визначали методом кількісної ПЛР, наявність посттранскрипційного контролю детектували методом репортерних генів. Результати. Використовуючи як модель клітинну лінію імморталізованих міобластів людини LHCN, показано індукцію ізоформи А2 фактора елонгації трансляції eEF1 при диференціації міобластів, наявність транскрипційного і посттранскрипційного контролю в даному процесі, а також потенційну участь мікро-РНК у процесі зміни експресії ізоформ. Висновки. Індукція ізоформи А2 протягом диференціації міобластів може відбуватися як на транскрипційному, так і на посттранскрипційному рівні. Ключові слова: eEF1A1, eEF1A2, імморталізовані міобласти людини LHCN, диференціація, мікроРНК

Non-canonical interactions of the β subunit of the translation elongation complex eEF1B and analysis of their possible functional role

Aim. To predict protein networks which may comprise the β subunit of the translation elongation complex eEF1B in lung carcinoma cell line. Methods. The protein partners of eEF1Bβ from cytoplasmic extract of A549 cells were identified by co-immunoprecipitation (co-IP) combined with liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The molecular interaction network for eEF1Bβ was predicted and visualized by a Cytoscape 3.2.0 program using an MCODE plugin. GO analysis of cellular distribution was performed by a STRAP Program. Results. 162 high-scored proteins interacting with eEF1Bβ in the cytoplasm of lung carcinoma cells A549 have been identified by mass-spectrometry. Possible functional networks involving these contacts were predicted bioinformatically. Conclusions. Four protein networks are identified as possible targets of eEF1Bβ in lung cancer cells. These groups are involved in the cell cycle regulation; DNA replication and repair; chromatin remodeling; chaperoning and signal transduction. The dataallow to narrow down further search for non-canonical cancer-related function of eEF1Bβ.Мета. Передбачити, до яких функціональних кластерів білків клітин карциноми легені А-549 може входити субодиниця β комплексу факторів елонгації трансляції eEF1B. Методи. Білки-партнери eEF1Bβ, отримані з цитоплазматичного екстракту клітин А549 методом ко-імунопреципітації (co-IP), були ідентифіковані за допомогою высокоефективної рідинної хроматографії з тандемною мас-спектрометрією (LC-MS/MS). Сітка молекулярних взаємодій eEF1Bβ була передбачена і побудована за допомогою програми Cytoscape 3.2.0 з використанням плагіна MCODE. Результати. Методом мас-спектрометрії було ідентифіковано 162 білка, що взаємодіють з eEF1Bβ в цитоплазмі клітин карциноми легені A549. Можливі функціональні сітки, що включають ці контакти, були передбачені біоінформатично. Висновки. Чотири білкові сітки були ідентифіковані як можливі мішені eEF1Bβ при раку. Ці групи білків залучені в регуляцію клітинного циклу; реплікацію та репарацію ДНК, ремоделювання хроматину; шаперонну функцію та сигнальну трансдукцію. Отриманні данні дозволяють звузити поле подальшого пошуку неканонічних, пов’язаних з раком функцій eEF1Bβ.Цель. Предсказать функциональные кластеры белков, в какие может быть вовлечена β субъединица комплекса факторов элонгации трансляции eEF1B в клетках карциномы легкого А549. Методы. Белки-партнёры eEF1Bβ, полученные из цитоплазматического экстракта клеток А549 методом ко-иммунопреципитации (co-IP), были идентифицированы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и последующей тандемной масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Сеть молекулярных взаимодействий eEF1Bβ была предсказана и построена с помощью программы Cytoscape 3.2.0 с использованием плагина MCODE. Результаты. Методом масс-спектрометрии было идентифицировано 162 белка, взаимодействующих с eEF1Bβ в цитоплазме клеток карциномы лёгкого A549. Возможные функциональные сети, включающие эти контакты, были предсказаны биоинфор-матически. Выводы. Четыре белковые сети были идентифицированы в качестве возможных мишеней eEF1Bβ при раке. Эти группы белков вовлечены в регуляцию клеточного цикла; репликацию и реперацию ДНК, ремоделирование хроматина; шаперонную функцию и сигнальную трансдукцию. Полученные данные позволяют сузить поле дальнейшего поиска неканонических, связанных с раком функций eEF1Bβ

Interaction of different tRNAs with translation elongation factors 1A from lower and higher eukaryotes

The work is aimed at confirmation of earlier assumed mechanism of tRNA channeling. Methods. The methods of band shift assay and Forsters resonance energy transfer were used. Results. The affinities of mammalian tRNAs for two tissue specific isoforms of elongator factor eEF1A1 and eEF1A2 were compared. For the first time we have shown the ability of yeast eEF1A*GDP to form non-canonical ternary complex with deacylated tRNAs. The complexation of eukaryotic eEF1A with initiator tRNA, of both bacterial and mammalian origin, was also demonstrated. Conclusions. The formation of the non-canonical complexes of eEF1A*GDP with deacylated tRNAs is common for higher and lower eukaryotes, which is in favor of universality of eukaryotic tRNA-channeling.Мета. Підтвердити запропонований раніше механізм каналювання тРНК. Методи. Зсув смуги в поліакриламідному гелі та Форстерівське резонансне перенесення енергії (FRET). Результати. Оцінено спорідненість тРНК ссавців з двома тканино-специфічними ізоформами фактораe еEF1A1 та eEF1A2. Вперше показано формування неканонічних потрійних комплексів дріжджового eEF1A*GDP з деацильованими тРНК. Продемонстровано також комплексоутворення еукаріотного eEF1A з ініціаторною тРНК ссавців і бактерій. Висновки. Формування неканонічних комплексів eEF1A*GDP з деацильованими тРНК є загальним для вищих і нижчих еукаріотів, що підтверджує універсальність еукаріотного каналювання тРНКЦель. Подтвердить предложенный ранее механизм каналирования тРНК. Методы. Сдвиг полосы в полиакриламидном геле и Форстеровский резонансный перенос энергии (FRET). Результаты. Оценено сродство тРНК млекопитающих с двумя тканеспецифическими изоформами фактора eEF1A1 и eEF1A2. Впервые показано формирование неканонических тройных комплексов дрожжевого eEF1A*GDP с деацилированными тРНК. Также продемонстрировано комплексообразование эукариотного eEF1A с инициаторной тРНК млекопитающих и бактерий. Выводы. Формирование неканонических комплексов eEF1A*GDP с деацилированными тРНК является общим для высших и низших эукариотов, что подтверждает универсальность эукариотного каналирования тРНК

Protein partners of the eEF1Bβ subunit of the translation elongation complex eEF1B in the nuclear fraction of human lung carcinoma cells

Aim. To identify novel protein partners of translation factor eEF1Bβ in nucleus of human lung carcinoma cells. Methods. Protein partners of eEF1Bβ in the nuclear fraction of A549 cells were identified by co-immunoprecipitation (co-IP) combined with liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Specific protein partners of eEF1Bβ were further selected by using the results of previously published global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellu-lar localization with help of “Mapofthecell” program. Results. 104 high-scored proteins interact-ing with eEF1Bβ in the nuclear fraction of A549 cells have been identified by mass-spectrometry. Among these proteins, 9 partners of eEF1Bβ were confirmed by the co-fractionation approach. Functional analysis of the partners has divided them on the pro-oncogenic (lung-cancer related) and neutral/anti-oncogenic moieties. These two groups are estimated to be spatially separated in human cancer cells. Conclusions. The position of eEF1Bβ as a link between the oncogenic and neutral/tumor-suppressor moieties of its protein partners in nucleus of lung cancer cells is sug-gested. Deciphering of a possible role of the eEF1Bβ distribution between the pro-cancer or anti-cancer communities of its protein partners can be a subject of further research.Мета. Виявити нових білків-партнерів фактора трансляції eEF1Bβ в ядрі клітин карциноми легені. Методи. Білки-партнери eEF1Bβ, отримані з ядерного екстракту клітин А549 методом ко-імунопреципітації (co-IP), були ідентифіковані за допомогою высокоефективної рідинної хроматографії з тандемною мас-спектрометрією (LC-MS/MS). Подальше підтвердження білків-партнерів проводили із використанням опублікованих даних глобального, кількісного і динамічного картування субклітинної локалізації білків за допомогою програми Mapofthecell. Результати. 104 білки, які взаємодіють із eEF1Bβ в ядерній фракції клітин карциноми легені A549 були ідентифіковані мас-спектрометрією. Проміж цих білків, 9 партнерів eEF1Bβ були підтверджені даними із прецизійного субклітинного фракціонування. За допомогою функціонального аналізу ці білки-партнери можуть бути поділені на про-онкогенну і нейтральну/анти-онкогенну групи. Передбачено, що ці групи можуть бути просторово розділені в ракових клітинах людини. Висновки. Запропоновано, що eEF1Bβ може бути проміжною ланкою між онкогенною і нейтральною/пухлиносупресорною групами партнерів цього білка в ядрі ракових клітин. Розшифрування можливої ролі залучення eEF1Bβ до про-ракової або анти-раковими спільнот білкових партнерів цього білку може бути предметом подальших дослiджень.Цель. Выявление новых белков-партнеров фактора трансляции eEF1Bβ в ядре клеток карциномы легкого. Методы. Белки-партнёры eEF1Bβ, полученные из ядерного экстракта клеток А549 методом ко-иммунопреципитации (co-IP), были идентифицированы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS). Дальнейшее подтверждение белков-партнеров проводили с использованием опубликованных ранее данных глобального, количественного и динамичного картирования субклеточной локализации белков с помощью программы «Mapofthecell». Результаты. Методом масс-спектрометрии было идентифицировано 104 белка, взаимодействующих с eEF1Bβ в ядре клеток A549. Из этих белков, 9 партнеров eEF1Bβ были подтверждены данными, полученными при подробном субклеточном фракционировании. С помощью функционального анализа эти белки-партнеры можно разделить на про-онкогенную і нейтральную/анти-онкогенную группы. Предсказано, что эти группы могут быть разделены в пространстве в раковых клетках человека. Выводы. Выдвинуто предположение, что eEF1Bβ может быть промежуточным звеном между онкогенной и нейтральной/опухоле-супрессорной группами его партнеров в ядре раковых клеток. Расшифровка возможной роли вовлечения eEF1Bβ в про-раковую или анти-раковую группы его белковых партнеров может быть предметом дальнейших исследований

Control of the amount and functionality of the eEF1A1 and eEF1A2 isoforms in mammalian cells

Aim. To review mechanisms of regulation of expression and the functionality of two isoforms of translation elongation factor eEF1A in mammalian cells. Results. eEF1A1 and eEF1A2 proteins are regulated by post-translational modifications, protein-protein and protein-tRNA interactions as well as by controlling the amount of their mRNAs in human cells. Conclusions. EEF1A1 mRNA levels in cancer cells may depend on the allelic copy number while the level of EEF1A2 mRNA may be controlled by micro RNAs. eEF1A2 protein activity in different cellular processes may be determined, in part, by its increased affinity for tRNA and viral RNAs as compared to eEF1A1. eEF1A1 activity can be regulated by its increased susceptibility to post-translational modifications (PTM) and protein-protein interactions (PTI) as compared to eEF1A2.Мета. Представити короткий огляд деяких механізмів, за допомогою яких клітини ссавців контролюють експресію і функціональність двох ізоформ фактора елонгації трансляції eEF1A. Результати. Описано клітинну тактику контроля білків eEF1A1 і eEF1A2 за участі пост-трансляційних модифікацій, білок-білкових та білок-РНКових взаємодій, а також регуляції кількості і стабільності EEF1A1 і EEF1A2 мРНК. Висновки. Рівень мРНК, що кодує еEF1A1 в ракових клітинах, може залежати від зміни кількості алельних копій, у той час, коли рівень EEF1A2 мРНК може контролюватися за допомогою мікро РНК. Активність білка еEF1A2 в різних клітинних процесах, може визначатися, зокрема, підвищеною, в порівнянні з еEF1A1, афінністю до тРНК і вірусної РНК. В свою чергу, активність еEF1A1 може регулюватися підвищеною, в порівнянні з еF1A2, доступністю цього білка до пост-трансляційних модифікацій і білок-білкових взаємодій.Цель. Представить краткий обзор некоторых механизмов, с помощью которых клетки млекопитающих контролируют экспрессию и функциональность двух изоформ фактора элонгации трансляции еEF1A. Результаты. Описано клеточную тактику контроля белков eEF1A1 и eEF1A2 с участием пост-трансляционных модификаций, белок-белковых и белок-РНКовых взаимодействий, а также регуляции количества и стабильности EEF1A1 и EEF1A2 мРНК. Выводы. Уровень мРНК, которая кодирует еEF1A1 в раковых клетках, может определяться измененным количеством аллельных копий, в то время как уровень мРНК, кодирующей еEF1A2, может контролироваться посредством микроРНК. Активность белка еEF1A2 в разных клеточных процессах может определяться, в частности, его увеличенной, в сравнении с eEF1A1, аффинностью к тРНК и вирусной РНК. В свою очередь, активность eEF1A1 может регулироваться увеличенными, по сравнению с eEF1A2, подверженностью этого белка пост-трансляционным модификациям и доступностью для белок-белковых взаимодействий

Leucine-zipper motif is responsible for self-association of translation elongation factor 1Bβ

Translation elongation factor 1Bβ (eEF1Bβ) is a metazoan-specific protein catalyzing the guanine nucleotide exchange on translation elongation factor 1A (eEF1A). eEF1Bβ was reported to form oligomers. Aim. To define the structural region of human eEF1Bβ that mediates its self-association. In addition, the various truncated forms of this protein were tested in the guanine nucleotide exchange assay with two isoforms of mammalian eEF1A. Methods. The truncated forms of eEF1Bβ were generated by PCR, cloned, expressed in Escherichia coli and purified to homogeneity. Their apparent molecular masses were determined by analytical gel filtration and their guanine nucleotide exchange activities were assessed by filter binding assay. Results. Complete deletion of the N-terminal domain of eEF1Bβ does not affect its oligomerization propensity while deletion of the leucine-zipper motif drastically decreases the apparent molecular mass of the truncated form compared to the full-length protein. Also, the leucine-zipper motif of eEF1Bβ fused to glutathione S-transferase causes oligomerization of the chimeric protein. It was demonstrated that all N-terminally truncated forms of eEF1Bβ displayed similar catalytic activity to that of the full-length protein. Weak inhibitory effect on the catalytic activity was observed only for the truncated form with partially deleted central acidic region. Conclusions. The leucine-zipper motif facilitates oligomerization of recombinant eEF1Bβ. Stepwise deletion of the eEF1Bβ N-terminal domain does not significantly affect the guanine nucleotide exchange activity of the truncated proteins.Фактор елонгації трансляції 1Bβ(eEF1Bβ) – це білок, наявний лише у багатоклітинних організмів. Він каталізує обмін гуанінових нуклеотидів на факторі елонгації трансляції 1A (eEF1A). Відомо, що eEF1Bβ утворює олігомери. Мета. Визначити структурний домен eEF1Bβ людини, який опосередковує його олігомеризацію. Для встановлення ймовірного впливу N-кінцевої ділянки eEF1Bβ на каталітичну активність цього білка, було перевірено здатність різних вкорочених форм eEF1Bβ каталізувати обмін гуанінових нуклеотидів на обох ізоформах eEF1A ссавців. Методи. Фрагменти кДНК, які кодують вкорочені форми, eEF1Bβ отримували шляхом ПЛР ампліфікації, потім клонували у відповідні вектори, які експресували в клітинах Escherichia coli. Рекомбінантні білки очищали і їхні молекулярні маси визначали аналітичною гель-фільтрацією. Активність вкорочених форм eEF1Bβ перевіряли в реакції обміну гуанінових нуклеотидів. Результати. Видалення N-кінцевого домену eEF1Bβ не вплинуло на його олігомерізацію, в той час як видалення мотиву типу «лейцинова застібка» значно зменшувало молекулярну масу вкороченої форми білка в порівнянні з повнорозмірною. Також, амінокислотний мотив eEF1Bβ типу «лейцинова застібка» злитий з глутатіон S-трансферазою спричиняв олігомерізацію цього химерного білка. Показано, що всі вкорочені з N-кінця форми eEF1Bβ проявляли каталітичну активність, подібну до повнорозмірного білка. Інгібіторний ефект на каталітичну активність спостерігався лише для вкороченої форми білка, в якої була відсутня частина центрального негативно зарядженого регіону. Висновки. Амінокислотний мотив типу «лейцинова застібка» сприяє олігомерізації рекомбінантного eEF1Bβ. Поступове вкорочення N-кінцевого домену не має значного впливу на каталітичну активність eEF1Bβ.Фактор элонгации трансляции 1Bβ (eEF1Bβ) – белок, присутствующий только в многоклеточных организмах. Он катализирует обмен гуаниновых нуклеотидов на факторе элонгации трансляции 1A (eEF1A). Известно, что eEF1Bβ образует олигомеры. Цель. Определить структурный домен eEF1Bβ человека, который вызывает его олигомеризацию. Для исследования возможного влияния N-концевого участка eEF1Bβ на каталитическую активность этого белка, мы проверили способность различных укороченных форм eEF1Bβ катализировать обмен гуаниновых нуклеотидов на обеих изоформах eEF1A млекопитающих. Методы. Фрагменты кДНК, кодирующие укороченные формы eEF1Bβ, получали при помощи ПЦР амплификации, потом клонировали в соответствующие вектора, которые экспрессировали в клетках Escherichia coli. Рекомбинантные белки очищали и их молекулярные массы определяли аналитической гель-фильтрацией. Активность укороченных форм eEF1Bβ проверяли в реакции обмена гуаниновых нуклеотидов. Результаты. Полное удаление N-концевого домена не влияло на олигомеризацию eEF1Bβ, однако удаление мотива типа «лейцинова застёжка» значительно уменьшало молекулярную массу укороченной формы белка по сравнению с полноразмерной. Также, присоединение аминокислотного мотива eEF1Bβ типа «лейциновая застёжка» к глутатион S-трансферазе вызвало олигомеризацию этого химерного белка. Показано, что все укороченные с N-конца формы eEF1Bβ проявляли такую же каталитическую активность, как и полноразмерный белок. Слабый ингибирующий эффект на каталитическую активность наблюдался лишь для укороченной формы белка с отсутствующей частью центрального негативно заряженного региона. Выводы. Аминокислотный мотив типа «лейциновая застёжка» способствует олигомеризации рекомбинантного eEF1Bβ. Постепенное укорочение N-концевого домена не оказывает значительного влияния на каталитическую активность eEF1Bβ

mRNAs coding for A1 and A2 isoforms of translation factor eEF1A demonstrate different half-lives while A1 and A2 proteins are similarly stable in MCF7 cells

Eukaryotic translation elongation factor 1A (eEF1A) exists as two 98 % homologous isoforms eEF1A1 and eEF1A2 that are tissue/development specific and differentially linked to apoptosis/cancerogenesis. A2 is overexpressed in a number of tumors while unusual expression of A1 is observed in injured muscles. To approach a possible mechanism underlying induced changes in the relative amounts of the isoforms we examined the intrinsic stability of the proteins and their mRNAs in human cancer cells. Aim. To estimate half-life of the isoforms of eEF1A at mRNA and protein level in human cancer cells. Methods. To measure mRNA stability the transcriptional block technique was applied, with subsequent analysis of the mRNA level by qPCR. To determine the protein decay rate the translation was blocked by cycloheximide and changes in the protein level were detected by Western blot. Results. Calculation of the protein stability revealed half-life of 72 for eEF1A1 and 95 hours for eEF1A2. Half-life of EEF1A1 and EEF1A2 mRNAs were 3 and 60 hours respectively. Conclusions. Despite similar protein stability, the isoforms of eEF1A dramatically differ in the half-lives of their mRNAs, suggesting that the mRNA decay mechanism is one of the main regulators of eEF1A1/A2 amount in MCF7 cancer cells.Евкаріотний фактор елонгації трансляції (eEF1A) існує у вигляді двох гомологічних на 98 % ізоформ eEF1A1 і eEF1A2, які є тканиноспецифічними, відрізняються за представленістю в онтогенезі та по-різному пов’язані з апоптозом і канцерогенезом. Згідно з попередніми даними, eEF1A2 має підвищений рівень експресії у деяких пухлинах, а eEF1A1 – у пошкоджених м’язах. Щоб зрозуміти механізм, за яким змінюється відносна кількість ізоформ, ми дослідили стабільність білків та їхніх мРНК у клітинах раку людини. Мета. Оцінити час напівжиття ізоформ eEF1A на рівні мРНК і білка в клітинах раку людини. Методи. Для вимірювання стабільності мРНК використано техніку блокування транскрипції з подальшим аналізом рівня мРНК із застосуванням кількісної ПЛР. Для визначення швидкості розпаду білка трансляцію блокували циклогексимідом, подальші зміни рівня білка виявляли методом Вестерн-блоту. Результати. За підрахунками, стабільність білка зберігалася протягом 72 год у разі eEF1A1 та 95 год – у разі eEF1A2. Значення часу напівжиття EEF1A1 і EEF1A2 мРНК становлять відповідно 3 і 60 год. Висновки. Незважаючи на подібні значення стабільності білка, ізоформи eEF1A значно відрізняються за часом напівжиття їхніх мРНК, внаслідок чого можна припустити, що контроль стабільності мРНК є одним з основних механізмів регуляції експресії eEF1A1/ A2 в клітинах раку молочної залози MCF7.Эукариотический фактор элонгации трансляции (eEF1A) существует в виде двух гомологичных на 98 % изоформ eEF1A1 и eEF1A2, являющихся тканеспецифическими, отличающихся представленностью в онтогенезе и по-разному связанных с апоптозом и канцерогенезом. Согласно наблюдениям, eEF1A2 имеет повышенный уровень экспрессии в некоторых опухолях, а eEF1A1 – в поврежденных мышцах. Чтобы понять механизм, по которому изменяется относительное количество изоформ, мы исследовали стабильность белков и их мРНК в клетках рака человека. Цель. Оценить время полужизни изоформ eEF1A на уровне мРНК и белка в клетках рака человека. Методы. Для измерения стабильности мРНК использовали технику блокирования транскрипции с последующим анализом уровня мРНК с применением количественной ПЦР. Для определения скорости распада белка трансляцию блокировали циклогексимидом, дальнейшие изменения уровня белка выявляли методом Вестерн-блота. Результаты. По расчетам, стабильность белка сохранялась в течение 72 ч в случае eEF1A1 и 95 ч – в случае eEF1A2. Время полужизни EEF1A1 и EEF1A2 мРНК составляло соответственно 3 и 60 ч. Выводы. Несмотря на подобные значения стабильности белка, изоформы eEF1A значительно отличаются по времени полужизни их мРНК, вследствие чего можно предположить, что контроль стабильности мРНК является одним из основных механизмов регуляции экспрессии eEF1A1/A2 в клетках рака молочной железы MCF7

Multisubunit complex eEF1H in human glial tumors: from mRNA to protein

Aim. To investigate protein level of all subunits of the eukaryotic elongation translation factor eEF1H (eEF1A, eEF1Bα, eEF1Bβ and eEF1Bγ) in glial tumors of human brain in comparison with normal brain. Methods. The eEF1H components content has been investigated in human glioblastoma clinical samples by Western blot analysis. Results. To determine the eEF1Bα, eEF1Bβ and eEF1Bγ content, the polyclonal antibodies against all eEF1H subunits were obtained. The tendency of the eEF1Bγ protein level to increase in glioblastomas was observed. There were no significant differences in the eEF1A, eEF1Bα and eEF1Bβ protein contents. Conclusions. In the previous report we analysed the expression of all eEF1H subunits in human glial brain tumor on the mRNA level. This study showed that eEF1Bγ was overexpressed while no significant changes in other eEF1H subunits were observed. It suggests a possible function of eEFBγ which is cancer-related and is not connected with the functioning of eEF1H complex in translation.Мета. Проаналізувати вміст усіх субодиниць фактора елонгації трансляції eEF1H (eEF1A, eEF1Bα, eEF1Bβ і eEF1Bγ) в гліальних пухлинах головного мозку людини порівняно з умовною нормою. Методи. Компоненти комплексу eEF1H досліджували у клінічних зразках гліальних пухлин людини Вестерн-блот-аналізом. Результати. Для визначення вмісту білків eEF1Bα, eEF1Bβ і eEF1Bγ отримано поліклональні антитіла до цих субодиниць. Спостерігали тенденцію до підвищення рівня білка eEF1B в гліобластомах. Відмінності в рівні білків eEF1A, eEF1Bα та eEF1Bβ в гліальних пухлинах у порівнянні з умовною нормою виявилися несуттєвими. Висновки. Ця робота є продовженням попередніх досліджень, де вивчали рівень мРНК, які кодують субодиниці комплексу eEF1H у пухлинах головного мозку людини. Виявлене зростання концентрації білка eEF1Bγ в гліобластомах, що відбувалося на фоні практичної відсутності розбіжностей в експресії інших субодиниць комплексу, може свідчити про виконання субодиницею eEF1Bγ певної пухлинозалежної ролі, окремої від трансляційної функції комплексу eEF1H.Цель. Проанализировать содержание всех субъединиц фактора элонгации трансляции eEF1H (eEF1A, eEF1Bα, eEF1Bβ и eEF1Bγ) в глиальных опухолях головного мозга человека по сравнению с условной нормой. Методы. Компоненты комплекса eEF1H исследовали в клинических образцах глиальных опухолей человека Вестерн-блот-анализом. Результаты. Для определения содержания белков eEF1Bα, eEF1Bβ и eEF1Bγ получены поликлональные антитела против этих субъединиц. Наблюдалась тенденция к повышению уровня белка eEF1Bγ в глиобластомах. Отличия в уровнях белков eEF1A, eEF1Bα и eEF1Вβ оказались несущественными. Выводы. Эта работа продолжает предыдущие исследования по изучению уровня мРНК, кодирующих субъединицы комплекса eEF1H в опухолях головного мозга человека. Выявленное увеличение концентрации белка eEF1Bγ в глиобластомах, происходящее на фоне практически отсутствующих изменений в уровнях экспрессии других субъединиц комплекса, может указывать на выполнение субъединицей eEF1Bγ определенной опухоль-зависимой роли, отдельной от трансляционного комплекса eEF1H

Mass-spectrometric and bioinformatic analysis of eEF1Bγ interactome in the cytoplasmic fraction of A549 cells

Aim. To study protein networks containing the translation elongation factor eEF1B gamma (eEF1Bγ) in lung carcinoma cells. Methods. The protein partners of eEF1Bγ in the cytoplasmic fraction of human lung adenocarcinoma A549 cells were identified by co-immunoprecipitation (co-IP) followed by subsequent liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The protein interaction network for eEF1Bγ was determined by a Cytoscape 3.2.0 program using a MCODE plugin. Results. 222 high-scored proteins interacting with eEF1Bγ in the cytoplasm of A549 cells have been identified. Possible functional networks involving these protein-protein interactions were predicted using bioinformatic approaches. Conclusions. Five protein networks were identified as possible targets of eEF1Bγ in lung cancer cells. Apart from translation, eEF1Bγγ was shown to be potentially involved in cell cycle regulation, nucleosome remodeling, transcription, mRNA splicing and processing, and oxidative stress response.Мета. Виявити білкові мережі, до яких може входити фактор елонгації трансляції eEF1Bγ в клітинах карциноми легені. Методи. Білки-партнери eEF1Bγ у цитоплазматичній фракції клітин аденокарциноми легені людини А549 були ідентифіковані за допомогою ко-іммунопреципітації із наступною рідинною хроматографією та тандемною мас-спектрометрією (LC-MS/MS). Білкові мережі, до яких входить eEF1Bγ, визначали за допомогою програми Cytoscape 3.2.0 із плагіном MCODE. Результати. Ідентифіковано 222 білки-партнери eEF1Bγ в цитоплазматичній фракції клітин А549. Функціональні мережі, які можуть формуватися цими білками, були визначені біоінформатично. Висновки. На основі експериментальних даних винайдено п’ять білкових мереж, у яких може брати участь eEF1Bγ в клітинах аденокарциноми легені людини. Показано, що крім трансляційних компонентів, ці мережі формуються білками, задіяними у регуляції клітинного циклу, ремоделюванні нуклеосом, транскрипції, сплайсингу і процесінгу мРНК та клітинної відповіді на оксидативний стрес.Цель. Выявить белковые сети, членом которых может быть фактор элонгации трансляции eEF1Bγ в клетках карциномы легкого. Методы. С помощью ко-иммунопреципитации с последующей жидкостной хроматографией и тандемной масс-спектрометрией были идентифицированы белки-партнеры eEF1Bγ в цитоплазматической фракции клеток аденокарциномы легкого людини А549. Белковые сети, в состав которых входит eEF1Bγ, определяли с помощью программы Cytoscape 3.2.0 с плагином MCODE. Результаты. Идентифицированы 222 белка-партнера eEF1Bγ в цитоплазматической фракции клеток А549. Функциональные сети, которые могут формироваться этими белками, были определены биоинформатически. Выводы. На основании экспериментальных данных найдено пять белкових сетей, в которых может участвовать eEF1Bγ в клетках аденокарциномы легкого человека. Показано, что кроме трансляционных компонентов, эти сети формируются белками, задействованными в регуляции клеточного цикла, ремоделировании нуклеосом, транскрипции, сплайсинга и процессинга мРНК и клеточного ответа на оксидативный стресс