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Expression und Funktion des Apoptose-assoziierten Moleküls PHLDA1 im humanen Melanom
Das Melanom ist aufgrund seiner frühzeitigen und häufigen Metastasierung sowie seiner
Resistenz gegenüber Chemotherapeutika einer der bösartigsten Tumoren des Menschen.
Trotz dieser großen medizinischen Bedeutung, ist über die molekularen Mechanismen der
Tumorigenese und Metastasierung bisher wenig bekannt. Deswegen ist die Identifizierung
und Charakterisierung von Genen, die in diesem Prozess eine Rolle spielen, von größter
Wichtigkeit.
PHLDA1 (pleckstrin homology-like domain family A member 1) wurde in unserem Labor
in einer mRNA differential display-Analyse auf der Suche nach Metastasierungs-
assoziierten Molekülen im Melanom isoliert. Es ist das humane Homolog zu dem murinen
TDAG51, das im Aktivierungs-induzierten Zelltod bei T-Zellen involviert ist. In der
vorliegenden Arbeit wurde PHLDA1 charakterisiert und seine Funktion im humanen
Melanom beschrieben.
Es wurden sechs monoklonale Antikörper gegen PHLDA1 generiert, charakterisiert und
die PHLDA1-Expression in der Westernblot-Analyse, in der Immunfluoreszenzfärbung auf
lebenden Zellen, sowie immunhistochemisch auf Gewebegefrierschnitten untersucht.
Dabei konnten folgende Resultate erzielt werden:
In 11 untersuchten Zelllinien aus Melanommetastasen war die PHLDA1-Proteinmenge
signifikant geringer (p < 0,0046) als in 17 Zelllinien aus Melanomprimärtumoren. Die
verminderte Expression von PHLDA1 ist somit eine typische Eigenschaft von Zelllinien,
die aus Melanommetastasen etabliert wurden.
In normalem Haut- und Lymphknotengewebe war das PHLDA1-Protein nicht zu
detektieren. Dagegen konnte in 55 untersuchten melanozytären Läsionen eine PHLDA1-
spezifische Färbung nachgewiesen werden. 80% der benignen Nävi, dagegen nur 41% der
Primärtumore und 22% der Metastasen zeigten eine starke und gleichmäßige PHLDA1-
Expression. Damit bestätigten die in vivo gemachten Untersuchungen die Resultate aus den
Versuchen mit den Zelllinien und zeigen, dass die PHLDA1-Expression während der
Tumorprogression des humanen Melanoms vom Primärtumor bis hin zur Metastase
herunterreguliert wird.
Mit den monoklonalen Anti-PHLDA1-Antikörpern konnte PHLDA1 als zytoplasmatisches
Protein lokalisiert werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass der zweite
Translationsstartpunkt des offenen Leserahmens von PHLDA1 verwendet wird. Zur Aufklärung der Funktion von PHLDA1, wurden jeweils vier stabile PHLDA1-
Transfektanten und zwei Neomycinvektor-Transfektanten in einer Melanomzelllinie und in
einer immortalisierten Epithelzelllinie generiert. Die Analyse der klonierten Transfektanten
ergab ein langsameres Wachstum der PHLDA1-Transfektanten, eine reduzierte
Klonierungseffizienz sowie ein reduziertes Vermögen Kolonien zu bilden. Außerdem
zeigten die PHLDA1-Transfektanten während des Wachstums eine stärkere
Kontaktinhibition.
Die konstitutive PHLDA1-Expression in den stabilen Transfektanten beeinflusste nicht den
Zellzyklus. Dagegen konnte sowohl mit Hilfe der Annexin-V-Bindung sowie mit dem
TdT-abhängigen Einbau von FITC-markiertem dUTP (tunel-assay) gezeigt werden, dass
die basale Apoptoserate in den PHDLA1-Transfektanten erhöht war. Auch die Behandlung
mit dem Chemotherapeutikum Doxorubicin erhöhte die Apoptoserate der PHLDA1-
Transfektanten signifikant gegenüber der Neomycinvektor-Transfektanten.
Um Aufschluss darüber zu bekommen auf welchem molekularen Weg PHLDA1 die
Apoptose beeinflusst, wurde nach zytoplasmatischen Interaktionspartnern von PHLDA1
im yeast two hybrid screen gesucht. Dabei konnten aus 5,6x106 gescreenten Hefeklonen
einer Gehirn-, einer Plazenta- und einer Hela-Genbank, zwei Gene isoliert werden, die in
Hefe spezifisch mit PHLDA1 interagierten. Bei einem Gen handelte es sich um die p47-
Untereinheit des humanen Translationsinitiationsfaktor eIF3, bei dem anderen Gen um das
MRG-Gen (mammary-derived growth inhibitor-related gene). Translations-
initiationsfaktoren werden mit der Blockade der Proteinbiosynthese während der Apoptose
in Verbindung gebracht und MRG ist als Gen identifiziert worden, dass eine
wachstumsreduzierende Wirkung auf Mammakarzinome ausübt. Ob die beiden Proteine
auch die physiologischen Bindungspartner von PHLDA1 sind, ist noch nicht eindeutig
geklärt.
Das Expressionsmuster von PHLDA1, zusammen mit den funktionellen Ergebnissen, läßt
vermuten, dass die starke PHLDA1-Expression in den Nävi für deren gutartigen Charakter
mitverantwortlich ist. Im Melanom wird im Verlauf der Tumorprogression die PHLDA1-
Expression schrittweise reduziert und korreliert dann mit der zunehmenden Deregulation
des Wachstums und der Ausbildung der Apoptoseresistenz. Die Assoziation zwischen der
PHLDA1-Expression und Apoptosesensitivität machen PHLDA1 zu einem interessanten
Zielgen für die Entwicklung einer effizienteren Chemotherapie beim Melanom
Expression und Funktion des Apoptose-assoziierten Moleküls PHLDA1 im humanen Melanom
Das Melanom ist aufgrund seiner frühzeitigen und häufigen Metastasierung sowie seiner
Resistenz gegenüber Chemotherapeutika einer der bösartigsten Tumoren des Menschen.
Trotz dieser großen medizinischen Bedeutung, ist über die molekularen Mechanismen der
Tumorigenese und Metastasierung bisher wenig bekannt. Deswegen ist die Identifizierung
und Charakterisierung von Genen, die in diesem Prozess eine Rolle spielen, von größter
Wichtigkeit.
PHLDA1 (pleckstrin homology-like domain family A member 1) wurde in unserem Labor
in einer mRNA differential display-Analyse auf der Suche nach Metastasierungs-
assoziierten Molekülen im Melanom isoliert. Es ist das humane Homolog zu dem murinen
TDAG51, das im Aktivierungs-induzierten Zelltod bei T-Zellen involviert ist. In der
vorliegenden Arbeit wurde PHLDA1 charakterisiert und seine Funktion im humanen
Melanom beschrieben.
Es wurden sechs monoklonale Antikörper gegen PHLDA1 generiert, charakterisiert und
die PHLDA1-Expression in der Westernblot-Analyse, in der Immunfluoreszenzfärbung auf
lebenden Zellen, sowie immunhistochemisch auf Gewebegefrierschnitten untersucht.
Dabei konnten folgende Resultate erzielt werden:
In 11 untersuchten Zelllinien aus Melanommetastasen war die PHLDA1-Proteinmenge
signifikant geringer (p < 0,0046) als in 17 Zelllinien aus Melanomprimärtumoren. Die
verminderte Expression von PHLDA1 ist somit eine typische Eigenschaft von Zelllinien,
die aus Melanommetastasen etabliert wurden.
In normalem Haut- und Lymphknotengewebe war das PHLDA1-Protein nicht zu
detektieren. Dagegen konnte in 55 untersuchten melanozytären Läsionen eine PHLDA1-
spezifische Färbung nachgewiesen werden. 80% der benignen Nävi, dagegen nur 41% der
Primärtumore und 22% der Metastasen zeigten eine starke und gleichmäßige PHLDA1-
Expression. Damit bestätigten die in vivo gemachten Untersuchungen die Resultate aus den
Versuchen mit den Zelllinien und zeigen, dass die PHLDA1-Expression während der
Tumorprogression des humanen Melanoms vom Primärtumor bis hin zur Metastase
herunterreguliert wird.
Mit den monoklonalen Anti-PHLDA1-Antikörpern konnte PHLDA1 als zytoplasmatisches
Protein lokalisiert werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass der zweite
Translationsstartpunkt des offenen Leserahmens von PHLDA1 verwendet wird. Zur Aufklärung der Funktion von PHLDA1, wurden jeweils vier stabile PHLDA1-
Transfektanten und zwei Neomycinvektor-Transfektanten in einer Melanomzelllinie und in
einer immortalisierten Epithelzelllinie generiert. Die Analyse der klonierten Transfektanten
ergab ein langsameres Wachstum der PHLDA1-Transfektanten, eine reduzierte
Klonierungseffizienz sowie ein reduziertes Vermögen Kolonien zu bilden. Außerdem
zeigten die PHLDA1-Transfektanten während des Wachstums eine stärkere
Kontaktinhibition.
Die konstitutive PHLDA1-Expression in den stabilen Transfektanten beeinflusste nicht den
Zellzyklus. Dagegen konnte sowohl mit Hilfe der Annexin-V-Bindung sowie mit dem
TdT-abhängigen Einbau von FITC-markiertem dUTP (tunel-assay) gezeigt werden, dass
die basale Apoptoserate in den PHDLA1-Transfektanten erhöht war. Auch die Behandlung
mit dem Chemotherapeutikum Doxorubicin erhöhte die Apoptoserate der PHLDA1-
Transfektanten signifikant gegenüber der Neomycinvektor-Transfektanten.
Um Aufschluss darüber zu bekommen auf welchem molekularen Weg PHLDA1 die
Apoptose beeinflusst, wurde nach zytoplasmatischen Interaktionspartnern von PHLDA1
im yeast two hybrid screen gesucht. Dabei konnten aus 5,6x106 gescreenten Hefeklonen
einer Gehirn-, einer Plazenta- und einer Hela-Genbank, zwei Gene isoliert werden, die in
Hefe spezifisch mit PHLDA1 interagierten. Bei einem Gen handelte es sich um die p47-
Untereinheit des humanen Translationsinitiationsfaktor eIF3, bei dem anderen Gen um das
MRG-Gen (mammary-derived growth inhibitor-related gene). Translations-
initiationsfaktoren werden mit der Blockade der Proteinbiosynthese während der Apoptose
in Verbindung gebracht und MRG ist als Gen identifiziert worden, dass eine
wachstumsreduzierende Wirkung auf Mammakarzinome ausübt. Ob die beiden Proteine
auch die physiologischen Bindungspartner von PHLDA1 sind, ist noch nicht eindeutig
geklärt.
Das Expressionsmuster von PHLDA1, zusammen mit den funktionellen Ergebnissen, läßt
vermuten, dass die starke PHLDA1-Expression in den Nävi für deren gutartigen Charakter
mitverantwortlich ist. Im Melanom wird im Verlauf der Tumorprogression die PHLDA1-
Expression schrittweise reduziert und korreliert dann mit der zunehmenden Deregulation
des Wachstums und der Ausbildung der Apoptoseresistenz. Die Assoziation zwischen der
PHLDA1-Expression und Apoptosesensitivität machen PHLDA1 zu einem interessanten
Zielgen für die Entwicklung einer effizienteren Chemotherapie beim Melanom
Relocation of Aurora B from centromeres to the central spindle at the metaphase to anaphase transition requires MKlp2
Mitotic kinases of the Polo and Aurora families are key regulators of chromosome segregation and cytokinesis. Here, we have investigated the role of MKlp1 and MKlp2, two vertebrate mitotic kinesins essential for cytokinesis, in the spatial regulation of the Aurora B kinase. Previously, we have demonstrated that MKlp2 recruits Polo-like kinase 1 (Plk1) to the central spindle in anaphase. We now find that in MKlp2 but not MKlp1-depleted cells the Aurora B–INCENP complex remains at the centromeres and fails to relocate to the central spindle. MKlp2 exerts dual control over Aurora B localization, because it is a binding partner for Aurora B, and furthermore for the phosphatase Cdc14A. Cdc14A can dephosphorylate INCENP and may contribute to its relocation to the central spindle in anaphase. We propose that MKlp2 is involved in the localization of Plk1, Aurora B, and Cdc14A to the central spindle during anaphase, and that the integration of signaling by these proteins is necessary for proper cytokinesis
Phosphorylation of mitotic kinesin-like protein 2 by polo-like kinase 1 is required for cytokinesis
We have investigated the function of mitotic kinesin-like protein (MKlp) 2, a kinesin localized to the central spindle, and demonstrate that its depletion results in a failure of cleavage furrow ingression and cytokinesis, and disrupts localization of polo-like kinase 1 (Plk1). MKlp2 is a target for Plk1, and phosphorylated MKlp2 binds to the polo box domain of Plk1. Plk1 also binds directly to microtubules and targets to the central spindle via its polo box domain, and this interaction controls the activity of Plk1 toward MKlp2. An antibody to the neck region of MKlp2 that prevents phosphorylation of MKlp2 by Plk1 causes a cytokinesis defect when introduced into cells. We propose that phosphorylation of MKlp2 by Plk1 is necessary for the spatial restriction of Plk1 to the central spindle during anaphase and telophase, and the complex of these two proteins is required for cytokinesis
High-pressure optical floating-zone growth of Li2FeSiO4 single crystals
We report the growth of mm-sized Pmnb-Li2FeSiO4 single crystals by means of
the optical floating-zone method at high argon pressure and describe the
conditions required for a stable growth process. The crystal structure is
determined and refined by single-crystal X-ray diffraction. The lattice
constants amount to a = 6.27837(3) A, b = 10.62901(6) A and c = 5.03099(3) A at
100 K. In addition, we present high-resolution neutron powder diffraction data
that suggest that the slight Li-Fe site exchange seems to be intrinsic to this
material. High quality of the crystal is confirmed by very sharp anomalies in
the static magnetic susceptibility and in the specific heat associated with the
onset of long-range antiferromagnetic order at TN = 17.0(5) K and pronounced
magnetic anisotropy for the three crystallographic axes. Furthermore, magnetic
susceptibility excludes the presence of sizable amounts of magnetic impurity
phases
Filled Carbon Nanotubes as Anode Materials for Lithium-Ion Batteries
Downsizing well-established materials to the nanoscale is a key route to
novel functionalities, in particular if different functionalities are merged in
hybrid nanomaterials. Hybrid carbon-based hierarchical nanostructures are
particularly promising for electrochemical energy storage since they combine
benefits of nanosize effects, enhanced electrical conductivity and integrity of
bulk materials. We show that endohedral multiwalled carbon nanotubes (CNT)
encapsulating high-capacity (here: conversion and alloying) electrode materials
have a high potential for use in anode materials for lithium-ion batteries
(LIB). There are two essential characteristics of filled CNT relevant for
application in electrochemical energy storage: (1) rigid hollow cavities of the
CNT provide upper limits for nanoparticles in their inner cavities which are
both separated from the fillings of other CNT and protected against
degradation. In particular, the CNT shells resist strong volume changes of
encapsulates in response to electrochemical cycling, which in conventional
conversion and alloying materials hinders application in energy storage
devices. (2) Carbon mantles ensure electrical contact to the active material as
they are unaffected by potential cracks of the encapsulate and form a stable
conductive network in the electrode compound. Our studies confirm that
encapsulates are electrochemically active and can achieve full theoretical
reversible capacity. The results imply that encapsulating nanostructures inside
CNT can provide a route to new high-performance nanocomposite anode materials
for LIB.Comment: Invite
The disruption of proteostasis in neurodegenerative diseases
Cells count on surveillance systems to monitor and protect the cellular proteome which, besides being highly heterogeneous, is constantly being challenged by intrinsic and environmental factors. In this context, the proteostasis network (PN) is essential to achieve a stable and functional proteome. Disruption of the PN is associated with aging and can lead to and/or potentiate the occurrence of many neurodegenerative diseases (ND). This not only emphasizes the importance of the PN in health span and aging but also how its modulation can be a potential target for intervention and treatment of human diseases.info:eu-repo/semantics/publishedVersio