Expression und Funktion des Apoptose-assoziierten Moleküls PHLDA1 im humanen Melanom

Das Melanom ist aufgrund seiner frühzeitigen und häufigen Metastasierung sowie seiner Resistenz gegenüber Chemotherapeutika einer der bösartigsten Tumoren des Menschen. Trotz dieser großen medizinischen Bedeutung, ist über die molekularen Mechanismen der Tumorigenese und Metastasierung bisher wenig bekannt. Deswegen ist die Identifizierung und Charakterisierung von Genen, die in diesem Prozess eine Rolle spielen, von größter Wichtigkeit. PHLDA1 (pleckstrin homology-like domain family A member 1) wurde in unserem Labor in einer mRNA differential display-Analyse auf der Suche nach Metastasierungs- assoziierten Molekülen im Melanom isoliert. Es ist das humane Homolog zu dem murinen TDAG51, das im Aktivierungs-induzierten Zelltod bei T-Zellen involviert ist. In der vorliegenden Arbeit wurde PHLDA1 charakterisiert und seine Funktion im humanen Melanom beschrieben. Es wurden sechs monoklonale Antikörper gegen PHLDA1 generiert, charakterisiert und die PHLDA1-Expression in der Westernblot-Analyse, in der Immunfluoreszenzfärbung auf lebenden Zellen, sowie immunhistochemisch auf Gewebegefrierschnitten untersucht. Dabei konnten folgende Resultate erzielt werden: In 11 untersuchten Zelllinien aus Melanommetastasen war die PHLDA1-Proteinmenge signifikant geringer (p < 0,0046) als in 17 Zelllinien aus Melanomprimärtumoren. Die verminderte Expression von PHLDA1 ist somit eine typische Eigenschaft von Zelllinien, die aus Melanommetastasen etabliert wurden. In normalem Haut- und Lymphknotengewebe war das PHLDA1-Protein nicht zu detektieren. Dagegen konnte in 55 untersuchten melanozytären Läsionen eine PHLDA1- spezifische Färbung nachgewiesen werden. 80% der benignen Nävi, dagegen nur 41% der Primärtumore und 22% der Metastasen zeigten eine starke und gleichmäßige PHLDA1- Expression. Damit bestätigten die in vivo gemachten Untersuchungen die Resultate aus den Versuchen mit den Zelllinien und zeigen, dass die PHLDA1-Expression während der Tumorprogression des humanen Melanoms vom Primärtumor bis hin zur Metastase herunterreguliert wird. Mit den monoklonalen Anti-PHLDA1-Antikörpern konnte PHLDA1 als zytoplasmatisches Protein lokalisiert werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass der zweite Translationsstartpunkt des offenen Leserahmens von PHLDA1 verwendet wird. Zur Aufklärung der Funktion von PHLDA1, wurden jeweils vier stabile PHLDA1- Transfektanten und zwei Neomycinvektor-Transfektanten in einer Melanomzelllinie und in einer immortalisierten Epithelzelllinie generiert. Die Analyse der klonierten Transfektanten ergab ein langsameres Wachstum der PHLDA1-Transfektanten, eine reduzierte Klonierungseffizienz sowie ein reduziertes Vermögen Kolonien zu bilden. Außerdem zeigten die PHLDA1-Transfektanten während des Wachstums eine stärkere Kontaktinhibition. Die konstitutive PHLDA1-Expression in den stabilen Transfektanten beeinflusste nicht den Zellzyklus. Dagegen konnte sowohl mit Hilfe der Annexin-V-Bindung sowie mit dem TdT-abhängigen Einbau von FITC-markiertem dUTP (tunel-assay) gezeigt werden, dass die basale Apoptoserate in den PHDLA1-Transfektanten erhöht war. Auch die Behandlung mit dem Chemotherapeutikum Doxorubicin erhöhte die Apoptoserate der PHLDA1- Transfektanten signifikant gegenüber der Neomycinvektor-Transfektanten. Um Aufschluss darüber zu bekommen auf welchem molekularen Weg PHLDA1 die Apoptose beeinflusst, wurde nach zytoplasmatischen Interaktionspartnern von PHLDA1 im yeast two hybrid screen gesucht. Dabei konnten aus 5,6x106 gescreenten Hefeklonen einer Gehirn-, einer Plazenta- und einer Hela-Genbank, zwei Gene isoliert werden, die in Hefe spezifisch mit PHLDA1 interagierten. Bei einem Gen handelte es sich um die p47- Untereinheit des humanen Translationsinitiationsfaktor eIF3, bei dem anderen Gen um das MRG-Gen (mammary-derived growth inhibitor-related gene). Translations- initiationsfaktoren werden mit der Blockade der Proteinbiosynthese während der Apoptose in Verbindung gebracht und MRG ist als Gen identifiziert worden, dass eine wachstumsreduzierende Wirkung auf Mammakarzinome ausübt. Ob die beiden Proteine auch die physiologischen Bindungspartner von PHLDA1 sind, ist noch nicht eindeutig geklärt. Das Expressionsmuster von PHLDA1, zusammen mit den funktionellen Ergebnissen, läßt vermuten, dass die starke PHLDA1-Expression in den Nävi für deren gutartigen Charakter mitverantwortlich ist. Im Melanom wird im Verlauf der Tumorprogression die PHLDA1- Expression schrittweise reduziert und korreliert dann mit der zunehmenden Deregulation des Wachstums und der Ausbildung der Apoptoseresistenz. Die Assoziation zwischen der PHLDA1-Expression und Apoptosesensitivität machen PHLDA1 zu einem interessanten Zielgen für die Entwicklung einer effizienteren Chemotherapie beim Melanom

Expression und Funktion des Apoptose-assoziierten Moleküls PHLDA1 im humanen Melanom

Das Melanom ist aufgrund seiner frühzeitigen und häufigen Metastasierung sowie seiner Resistenz gegenüber Chemotherapeutika einer der bösartigsten Tumoren des Menschen. Trotz dieser großen medizinischen Bedeutung, ist über die molekularen Mechanismen der Tumorigenese und Metastasierung bisher wenig bekannt. Deswegen ist die Identifizierung und Charakterisierung von Genen, die in diesem Prozess eine Rolle spielen, von größter Wichtigkeit. PHLDA1 (pleckstrin homology-like domain family A member 1) wurde in unserem Labor in einer mRNA differential display-Analyse auf der Suche nach Metastasierungs- assoziierten Molekülen im Melanom isoliert. Es ist das humane Homolog zu dem murinen TDAG51, das im Aktivierungs-induzierten Zelltod bei T-Zellen involviert ist. In der vorliegenden Arbeit wurde PHLDA1 charakterisiert und seine Funktion im humanen Melanom beschrieben. Es wurden sechs monoklonale Antikörper gegen PHLDA1 generiert, charakterisiert und die PHLDA1-Expression in der Westernblot-Analyse, in der Immunfluoreszenzfärbung auf lebenden Zellen, sowie immunhistochemisch auf Gewebegefrierschnitten untersucht. Dabei konnten folgende Resultate erzielt werden: In 11 untersuchten Zelllinien aus Melanommetastasen war die PHLDA1-Proteinmenge signifikant geringer (p < 0,0046) als in 17 Zelllinien aus Melanomprimärtumoren. Die verminderte Expression von PHLDA1 ist somit eine typische Eigenschaft von Zelllinien, die aus Melanommetastasen etabliert wurden. In normalem Haut- und Lymphknotengewebe war das PHLDA1-Protein nicht zu detektieren. Dagegen konnte in 55 untersuchten melanozytären Läsionen eine PHLDA1- spezifische Färbung nachgewiesen werden. 80% der benignen Nävi, dagegen nur 41% der Primärtumore und 22% der Metastasen zeigten eine starke und gleichmäßige PHLDA1- Expression. Damit bestätigten die in vivo gemachten Untersuchungen die Resultate aus den Versuchen mit den Zelllinien und zeigen, dass die PHLDA1-Expression während der Tumorprogression des humanen Melanoms vom Primärtumor bis hin zur Metastase herunterreguliert wird. Mit den monoklonalen Anti-PHLDA1-Antikörpern konnte PHLDA1 als zytoplasmatisches Protein lokalisiert werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass der zweite Translationsstartpunkt des offenen Leserahmens von PHLDA1 verwendet wird. Zur Aufklärung der Funktion von PHLDA1, wurden jeweils vier stabile PHLDA1- Transfektanten und zwei Neomycinvektor-Transfektanten in einer Melanomzelllinie und in einer immortalisierten Epithelzelllinie generiert. Die Analyse der klonierten Transfektanten ergab ein langsameres Wachstum der PHLDA1-Transfektanten, eine reduzierte Klonierungseffizienz sowie ein reduziertes Vermögen Kolonien zu bilden. Außerdem zeigten die PHLDA1-Transfektanten während des Wachstums eine stärkere Kontaktinhibition. Die konstitutive PHLDA1-Expression in den stabilen Transfektanten beeinflusste nicht den Zellzyklus. Dagegen konnte sowohl mit Hilfe der Annexin-V-Bindung sowie mit dem TdT-abhängigen Einbau von FITC-markiertem dUTP (tunel-assay) gezeigt werden, dass die basale Apoptoserate in den PHDLA1-Transfektanten erhöht war. Auch die Behandlung mit dem Chemotherapeutikum Doxorubicin erhöhte die Apoptoserate der PHLDA1- Transfektanten signifikant gegenüber der Neomycinvektor-Transfektanten. Um Aufschluss darüber zu bekommen auf welchem molekularen Weg PHLDA1 die Apoptose beeinflusst, wurde nach zytoplasmatischen Interaktionspartnern von PHLDA1 im yeast two hybrid screen gesucht. Dabei konnten aus 5,6x106 gescreenten Hefeklonen einer Gehirn-, einer Plazenta- und einer Hela-Genbank, zwei Gene isoliert werden, die in Hefe spezifisch mit PHLDA1 interagierten. Bei einem Gen handelte es sich um die p47- Untereinheit des humanen Translationsinitiationsfaktor eIF3, bei dem anderen Gen um das MRG-Gen (mammary-derived growth inhibitor-related gene). Translations- initiationsfaktoren werden mit der Blockade der Proteinbiosynthese während der Apoptose in Verbindung gebracht und MRG ist als Gen identifiziert worden, dass eine wachstumsreduzierende Wirkung auf Mammakarzinome ausübt. Ob die beiden Proteine auch die physiologischen Bindungspartner von PHLDA1 sind, ist noch nicht eindeutig geklärt. Das Expressionsmuster von PHLDA1, zusammen mit den funktionellen Ergebnissen, läßt vermuten, dass die starke PHLDA1-Expression in den Nävi für deren gutartigen Charakter mitverantwortlich ist. Im Melanom wird im Verlauf der Tumorprogression die PHLDA1- Expression schrittweise reduziert und korreliert dann mit der zunehmenden Deregulation des Wachstums und der Ausbildung der Apoptoseresistenz. Die Assoziation zwischen der PHLDA1-Expression und Apoptosesensitivität machen PHLDA1 zu einem interessanten Zielgen für die Entwicklung einer effizienteren Chemotherapie beim Melanom

Phosphorylation of mitotic kinesin-like protein 2 by polo-like kinase 1 is required for cytokinesis

We have investigated the function of mitotic kinesin-like protein (MKlp) 2, a kinesin localized to the central spindle, and demonstrate that its depletion results in a failure of cleavage furrow ingression and cytokinesis, and disrupts localization of polo-like kinase 1 (Plk1). MKlp2 is a target for Plk1, and phosphorylated MKlp2 binds to the polo box domain of Plk1. Plk1 also binds directly to microtubules and targets to the central spindle via its polo box domain, and this interaction controls the activity of Plk1 toward MKlp2. An antibody to the neck region of MKlp2 that prevents phosphorylation of MKlp2 by Plk1 causes a cytokinesis defect when introduced into cells. We propose that phosphorylation of MKlp2 by Plk1 is necessary for the spatial restriction of Plk1 to the central spindle during anaphase and telophase, and the complex of these two proteins is required for cytokinesis

High-pressure optical floating-zone growth of Li2FeSiO4 single crystals

We report the growth of mm-sized Pmnb-Li2FeSiO4 single crystals by means of the optical floating-zone method at high argon pressure and describe the conditions required for a stable growth process. The crystal structure is determined and refined by single-crystal X-ray diffraction. The lattice constants amount to a = 6.27837(3) A, b = 10.62901(6) A and c = 5.03099(3) A at 100 K. In addition, we present high-resolution neutron powder diffraction data that suggest that the slight Li-Fe site exchange seems to be intrinsic to this material. High quality of the crystal is confirmed by very sharp anomalies in the static magnetic susceptibility and in the specific heat associated with the onset of long-range antiferromagnetic order at TN = 17.0(5) K and pronounced magnetic anisotropy for the three crystallographic axes. Furthermore, magnetic susceptibility excludes the presence of sizable amounts of magnetic impurity phases

The disruption of proteostasis in neurodegenerative diseases

Cells count on surveillance systems to monitor and protect the cellular proteome which, besides being highly heterogeneous, is constantly being challenged by intrinsic and environmental factors. In this context, the proteostasis network (PN) is essential to achieve a stable and functional proteome. Disruption of the PN is associated with aging and can lead to and/or potentiate the occurrence of many neurodegenerative diseases (ND). This not only emphasizes the importance of the PN in health span and aging but also how its modulation can be a potential target for intervention and treatment of human diseases.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

KIF14 and citron kinase act together to promote efficient cytokinesis

Multiple mitotic kinesins and microtubule-associated proteins (MAPs) act in concert to direct cytokinesis (Glotzer, M. 2005. Science. 307:1735-1739). In anaphase cells, many of these proteins associate with an antiparallel array of microtubules termed the central spindle. The MAP and microtubule-bundling protein PRC1 (protein-regulating cytokinesis 1) is one of the key molecules required for the integrity of this structure (Jiang, W., G. Jimenez, N.J. Wells, T.J. Hope, G.M. Wahl, T. Hunter, and R. Fukunaga. 1998. Mol. Cell. 2:877-885; Mollinari, C., J.P. Kleman, W. Jiang, G. Schoehn, T. Hunter, and R.L. Margolis. 2002. J. Cell Biol. 157:1175-1186). In this study, we identify an interaction between endogenous PRC1 and the previously uncharacterized kinesin KIF14 as well as other mitotic kinesins (MKlp1/CHO1, MKlp2, and KIF4) with known functions in cytokinesis (Hill, E., M. Clarke, and F.A. Barr. 2000. EMBO J. 19:5711-5719; Matuliene, J., and R. Kuriyama. 2002. Mol. Biol. Cell. 13:1832-1845; Kurasawa, Y., W.C. Earnshaw, Y. Mochizuki, N. Dohmae, and K. Todokoro. 2004. EMBO J. 23:3237-3248). We find that KIF14 targets to the central spindle via its interaction with PRC1 and has an essential function in cytokinesis. In KIF14-depleted cells, citron kinase but not other components of the central spindle and cleavage furrow fail to localize. Furthermore, the localization of KIF14 and citron kinase to the central spindle and midbody is codependent, and they form a complex depending on the activation state of citron kinase. Contrary to a previous study (Di Cunto, F., S. Imarisio, E. Hirsch, V. Broccoli, A. Bulfone, A. Migheli, C. Atzori, E. Turco, R. Triolo, G.P. Dotto, et al. 2000. Neuron. 28:115-127), we find a general requirement for citron kinase in human cell division. Together, these findings identify a novel pathway required for efficient cytokinesis