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Identificaci贸n de nuevos componentes de la ruta TOR de Fusarium oxysporum y determinaci贸n de su papel en la patog茅nesis
El crecimiento infeccioso de pat贸genos f煤ngicos es controlado por
distintas se帽ales ambientales, tal como el estado de nutrientes. El hongo
Fusarium oxysporum es un pat贸geno del suelo causante de la marchitez
vascular, una enfermedad que provoca p茅rdidas importantes en a un amplio
rango de especies de plantas. Adem谩s, F. oxysporum es un pat贸geno
oportunista capaz de producir infecciones en humanos, ello queda reflejado
en el aumento de casos de pacientes inmunodeprimidos con infecciones
sist茅micas que, en algunas ocasiones, son letales. La capacidad de una
煤nica cepa de F. oxysporum de causar enfermedad tanto en plantas de
tomate como en ratones inmunodeprimidos hace que esta sirva de modelo
para el an谩lisis gen茅tico de la patogenicidad en plantas y animales.
El presente trabajo tuvo como primer objetivo poner a punto el uso de
la polilla de la cera Galleria mellonella como modelo de infecci贸n alternativo
al rat贸n, para profundizar en el estudio de los mecanismos de virulencia de F.
oxysporum en animales. F. oxysporum fue capaz de proliferar en larvas de G.
mellonella y matar al hospedador tras inyectar microconidios en el hemocele.
La mortalidad de las larvas depend铆a de la dosis de in贸culo y fue
significativamente m谩s r谩pida a 30潞C que a 37潞C. Mutantes de F. oxysporum
previamente examinados en plantas de tomate y ratones inmunodeprimidos
fueron inoculados en Galleria, observ谩ndose una buena correlaci贸n entre los
dos modelos animales de infecci贸n. Por tanto, G. mellonella representa un
sistema 煤til de coste asumible y 茅ticamente aceptable, para el estudio de los
mecanismos de virulencia de F. oxysporum en animales.
La segunda parte del trabajo se centr贸 en la identificaci贸n y
caracterizaci贸n de distintos componentes de la cascada TOR en
F. oxysporum y el papel de dicha ruta en el desarrollo y la virulencia del
hongo. La prote铆na quinasa TOR est谩 presente en todos los organismos
eucariotas y controla el crecimiento y la proliferaci贸n celular en respuesta a
nutrientes y otros est铆mulos ambientales. Actualmente se desconoce el papel
de dicha ruta en la patog茅nesis f煤ngica. El an谩lisis in silico del genoma de F.
oxysporum, revel贸 la existencia de genes ort贸logos de varios componentes
de la ruta TOR caracterizados en mam铆feros y en Saccharomyces cerevisiae.
Para estudiar la funci贸n de estos componentes en F. oxysporum, se crearon
una serie de mutantes mediante transformaci贸n gen茅tica y recombinaci贸n
hom贸loga.
El primer aspecto abordado fue el papel del gen rim15, responsable
de una quinasa regulada negativamente por TOR, que controla la entrada en
la fase de quiescencia G0. Aunque la deleci贸n de rim15 no tuvo un efecto
significativo en el crecimiento y el desarrollo del hongo, si caus贸 una
disminuci贸n de los s铆ntomas de enfermedad durante la infecci贸n de plantas y
de G. mellonella...Infectious growth in fungal pathogens is controlled by environmental
cues, including nutrient status. The fungus Fusarium oxysporum is a soilborne
pathogen that produces vascular wilt disease on a wide range of different crop
species. F. oxysporum is also considered an opportunistic pathogen able to
cause lethal systemic infections in immunodepressed humans. A single strain
of F. oxysporum can cause disease on tomato plants and immunosuppressed
mice, making of it an ideal model for the analysis of virulence on plant and
animal hosts.
The first goal of the present work was to establish the use of the wax
moth Galleria mellonella as an alternative to the mouse model, to study
virulence mechanisms of F. oxysporum in animal hosts. F. oxysporum was
able to proliferate in larvae of G. mellonella and kill the host when injected as
microconidia into the hemocoel. Mortality depended on the dose of inoculum
and was significantly more severe at 30掳C than at 37掳C. Fungal gene
knockout mutants previously tested in the tomato and immunodepressed
mouse systems were applied in the Galleria model revealing a good
correlation between the two animal models. Thus, G. mellonella represents a
useful, cost-effective and ethically acceptable system for testing animal
pathogenicity in F. oxysporum.
The second part of this work focused on the identification and
characterization of components of the TOR cascade in F. oxysporum. The
TOR protein kinase is conserved in all eukaryotic organisms and controls
cellular growth and proliferation in response to nutrients and other
environmental factors. Currently, the role of this cellular pathway in fungal
pathogenicity is unknown. In silico analysis of the genome of F. oxysporum
revealed the existence of orthologues of several known components of the
TOR pathway in mammals and Saccharomyces cerevisiae. To study the
function of these components in the development and the virulence of F.
oxysporum, a series of mutants were created by genetic transformation and
homologous recombination.
The first approach was to study the role of Rim15 in F. oxysporum.
Rim15 is a kinase negatively regulated by TOR, that controls entry into the G0
quiescence phase. Although deletion of rim15 did not affect growth and
development of the fungus, it caused an attenuation of disease symptoms
during infection of tomato plants and larvae of G. mellonella.
Moreover, we studied the role of TOR signalling pathway by
generating mutations in four upstream components of TOR: the putative
amino acid transporters Slc1A5 and Slc7A5, the GTPase Gtr1 and the
GTPase regulator Tsc2 (tuberous sclerosis complex 2). Deletion of the genes
slc1a5 or slc7a5 did not affect growth and development of F. oxysporum, but
impaired the ability to use certain amino acids such as leucine, and caused a
decrease in disease symptoms during infection of tomato plants and G.
mellonella. Inactivation of Tsc2 or expression of a constitutively active allele of
gtr1 caused hyperactivation of TOR with distinct phenotypical effects. The..