Shigella Effector IpaB-Induced Cholesterol Relocation Disrupts the Golgi Complex and Recycling Network to Inhibit Host Cell Secretion

Shigella infection causes destruction of the human colonic epithelial barrier. The Golgi network and recycling endosomes are essential for maintaining epithelial barrier function. Here we show that Shigella epithelial invasion induces fragmentation of the Golgi complex with consequent inhibition of both secretion and retrograde transport in the infected host cell. Shigella induces tubulation of the Rab11-positive compartment, thereby affecting cell surface receptor recycling. The molecular process underlying the observed damage to the Golgi complex and receptor recycling is a massive redistribution of plasma membrane cholesterol to the sites of Shigella entry. IpaB, a virulence factor of Shigella that is known to bind cholesterol, is necessary and sufficient to induce Golgi fragmentation and reorganization of the recycling compartment. Shigella infection-induced Golgi disorganization was also observed in vivo, suggesting that this mechanism affecting the sorting of cell surface molecules likely contributes to host epithelial barrier disruption associated with Shigella pathogenesis

CD44 Promotes Intoxication by the Clostridial Iota-Family Toxins

International audienceVarious pathogenic clostridia produce binary protein toxins associated with enteric diseases of humans and animals. Separate binding/translocation (B) components bind to a protein receptor on the cell surface, assemble with enzymatic (A) component(s), and mediate endocytosis of the toxin complex. Ultimately there is translocation of A component(s) from acidified endosomes into the cytosol, leading to destruction of the actin cytoskeleton. Our results revealed that CD44, a multifunctional surface protein of mammalian cells, facilitates intoxication by the iota family of clostridial binary toxins. Specific antibody against CD44 inhibited cytotoxicity of the prototypical Clostridium perfringens iota toxin. Versus CD44(+) melanoma cells, those lacking CD44 bound less toxin and were dose-dependently resistant to C. perfringens iota, as well as Clostridium difficile and Clostridium spiroforme iota-like, toxins. Purified CD44 specifically interacted in vitro with iota and iota-like, but not related Clostridium botulinum C2, toxins. Furthermore, CD44 knockout mice were resistant to iota toxin lethality. Collective data reveal an important role for CD44 during intoxication by a family of clostridial binary toxins

Les facteurs spécifiques de l'endocytose indépendante de la clathrine suivie par les récepteurs de cytokines

L endocytose est le processus qui permet l entrée spécifique et active dans la cellule du milieu extracellulaire et des substances qu il contient. Ces dernières années, plusieurs mécanismes d endocytose ont été identifiés, mais seule la voie impliquant la clathrine a été bien caractérisée. Il a été montré que certains récepteurs de cytokines comme celui de l interleukine-2 (IL-2) empruntent une voie d endocytose indépendante de la clathrine. Précédemment, mon laboratoire a identifié huit facteurs impliqués dans cette voie d entrée dont l actine et la dynamine. Nous savons notamment que l activation de la RhoGTPase Rac1 permet l induction des kinases Pak1 et Pak2 régulant ainsi la cortactine, le recrutement de N-WASP et la polymérisation d actine nécessaire à l internalisation de l IL-2R. Cependant, les facteurs en amont de cette cascade Rac-Pak étaient inconnus et le rôle du cytosquelette d actine restait mal défini. Les travaux que j ai effectué durant mon doctorat ont mis en évidence que la PI3K en interagissant avec l IL-2R, permettait la production locale de PI(3,4,5)P3 qui induisait le recrutement de Vav2; un facteur conduisant à l activation de Rac1. De plus, j ai montré que Rac1 activé était ensuite recruté par la PI3K, permettant ainsi l activation locale de la cascade Rac/Pak lors de l entrée de l IL-2R. Ces données, qui ont fait l objet d une publication, ont montré que la PI3K n était pas seulement impliquée dans la signalisation de l IL-2, mais également dans son endocytose. Par la suite, la réalisation d un crible par ARNi portant sur l étude du rôle de 324 protéines humaines lors de l entrée de l IL-2R, a permis l identification de 65 nouveaux facteurs impliqués dans ce mécanisme. Parmi ces protéines, j ai étudié plus particulièrement le rôle du complexe WAVE connu pour être induit à la membrane plasmique par Rac1 et la PI3K. J ai confirmé l implication de ce complexe lors de l entrée de l IL-2R et mis en évidence qu il interagissait avec le récepteur. De plus, cette étude a montré que le complexe WAVE était impliqué précocement dans ce mécanisme, probablement en permettant le recrutement du récepteur aux pieds de protrusions membranaires que le complexe pourrait induire. Cette localisation spécifique du récepteur suggère ainsi un nouveau mécanisme de formation des vésicules d endocytose dont le puits s initierait à partir des invaginations existantes à la base des protrusions membranaires.Endocytosis is a basic and essential process used by eukaryotic cells to internalize, actively and specifically, a wide range of molecules. To date, several endocytic routes have been characterized, but the only well studied pathway is clathrin-dependent. This study focuses on a poorly characterized mechanism, the clathrin-independent endocytosis, used by several cytokine receptors such as the interleukin 2 receptors (IL-2R). Previously, my lab identified 8 factors in this process, most of them are related to actin polymerization and dynamin. We now know that the activation of the RhoGTPase Rac1 is required to induce Paks that regulate cortactin, N-WASP recruitment and actin polymerization essential for IL-2R uptake. However, upstream factors involved in the Rac-Pak cascade were unknown and the actin cytoskeleton function poorly characterised. During my PhD, I showed that IL-2R and the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) interact, leading to the local production of phosphatidylinositol (3,4,5)-triphosphate (PIP3) and the recruitment by this lipid of the RacGEF Vav2, an activator of Rac1. In addition, I showed that activated Rac1 was able to interact with PI3K allowing the local activation of the Rac-Pak cascade during IL-2R entry. These published data highlight the dual role of PI3K as a regulator of both IL-2R endocytosis and IL-2 signaling. In an attempt to identify new actors involved in the endocytosis of IL-2R, I then performed a small interfering RNA (siRNA) screening, targeting 324 proteins involved mainly in membrane deformation. From this screening we identified 65 proteins and among them we found the WAVE complex as a new factor implicated in IL-2R uptake. Interestingly, to be recruited and activated at the plasma membrane, the WAVE complex required Rac1 and PI3K, two proteins essentials during IL-2R entry. First, I confirmed the results obtained from the screening and found that IL-2R can interact with the WAVE complex. In addition, I observed an early involvement of this complex during IL-2R uptake, which could be needed for the localization of the receptor at the basis of plasma membrane protrusions. These results reveal a new model for the formation of endocytic vesicles: IL-2R is recruited at the basis of WAVE-induced membrane protrusions initiating the pit and vesicle.PARIS11-SCD-Bib. électronique (914719901) / SudocSudocFranceF

Endocytose indépendante de la clathrine (lien entre le cytosquelette d'actine et l'internalisation du récepteur de l'interleukine 2)

L endocytose est un processus cellulaire essentiel qui permet l internalisation de molécules du milieu extracellulaire. Différents mécanismes d endocytose existent. L endocytose par récepteur permet de contrôler l entrée de molécules par leur fixation à un récepteur spécifique. Mon travail de thèse a porté sur l identification de nouveaux acteurs et l étude des mécanismes de régulation impliqués dans l endocytose du récepteur d une cytokine, l interleukine 2 (IL-2R). Ce mécanisme est encore peu caractérisé : il a été montré que ce mécanisme était indépendant de la clathrine et dépendant du cytosquelette d actine et de la dynamine, une GTPase impliquée dans la scission des vésicules. Nous avons montré que Rac1, une Rho GTPase, pouvait réguler spécifiquement l internalisation de l IL-2R en agissant en amont des kinases Pak1 et Pak2. Par la suite, nous avons identifié dans ce mécanisme l implication de la cortactine, une protéine permettant de relier la machinerie d endocytose au cytosquelette d actine. Nous avons montré que la kinase Pak1 pouvait phosphoryler la cortactine au niveau des résidus sérine 405 et 418. Ces phosphorylations permettent de réguler l interaction de la cortactine avec N-WASP, un autre activateur de la polymérisation d actine. Ce travail nous a permis de proposer un modèle de régulation spécifique de l entrée de l IL-2R composé des protéines Rac1, Pak1, de la cortactine et de N-WASP. De plus, pendant ce travail de thèse, nous avons également réalisé un crible utilisant l ARN à interférence sur l ensemble des kinases humaines afin d identifier de nouveaux facteurs impliqués dans l entrée de l IL-2R. Les résultats de ce projet sont en cours d analyse.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Organ‐on‐chip to investigate host‐pathogens interactions

International audienceInfectious diseases remain the subject of intense research. This topic reaches a new era towards the study of host-pathogen interactions mechanisms at the tissue scale. The past few years have hence witnessed the emergence of new methods. Among them, organ-on-chip, which combines biomaterial technology, microfluidic and tissue engineering to recreate the organ physiology is very promising. This review summarises how this technology recapitulates the architecture, the mechanical stimulation and the interface of a tissue and how this particular microenvironment is critical to study host-pathogen interactions

JCB: ARTICLE Cortactin and dynamin are required for the clathrinindependent endocytosis of �c cytokine receptor

Endocytosis is critical for many cellular functions. We show that endocytosis of the common �c cytokine receptor is clathrin independent by using a dominantnegative mutant of Eps15 or RNA interference to knock down clathrin heavy chain. This pathway is synaptojanin independent and requires the GTPase dynamin. In addition, this process requires actin polymerization. To further characterize the function of dynamin in clathrin-independent endocytosis, in particular its connection with the actin cytoskeleton, we focused on dynamin-binding protein

Ready, set, internalize: mechanisms and regulation of GLUT4 endocytosis

The facilitative glucose transporter GLUT4, a recycling membrane protein, is required for dietary glucose uptake into muscle and fat cells. GLUT4 is also responsible for the increased glucose uptake by myofibres during muscle contraction. Defects in GLUT4 membrane traffic contribute to loss of insulin-stimulated glucose uptake in insulin resistance and Type 2 diabetes. Numerous studies have analysed the intracellular membrane compartments occupied by GLUT4 and the mechanisms by which insulin regulates GLUT4 exocytosis. However, until recently, GLUT4 internalization was less well understood. In the present paper, we review: (i) evidence supporting the co-existence of clathrin-dependent and independent GLUT4 internalization in adipocytes and muscle cells; (ii) the contrasting regulation of GLUT4 internalization by insulin in these cells; and (iii) evidence suggesting regulation of GLUT4 endocytosis in muscle cells by signals associated with muscle contraction