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Desenvolvimento da PCR em tempo real para amplificação do gene da Enzima Málica (ME) em isolados de Giardia duodenalis
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Desenvolvimento da PCR em Tempo Real para.pdf: 2139383 bytes, checksum: 1075a6c994ede19cfbf82267ae9a76b9 (MD5)
Previous issue date: 2010CNPq e FAPESPFundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.Giardia duodenalis (G. duodenalis) é um protozoário entérico patogênico distribuído
mundialmente e apresenta amplo espectro de hospedeiros mamíferos, incluindo
humanos. Isolados deste parasito possuem grande diversidade genética,
apresentando sete genótipos (A-G) e diversos subtipos. No entanto, apenas os
genótipos A e B infectam o homem e no subtipo A1 concentra-se o potencial
zoonótico do parasito. Análise das sequências de amplicons de determinados
marcadores moleculares demonstrou resultados discordantes na genotipagem de G.
duodenalis evidenciando a necessidade de identificar novos marcadores. A proposta
desse trabalho foi avaliar a aplicabilidade do locus da enzima málica (ME)
comparando os resultados obtidos com o gene da β-giardina (βg) usando a PCR
convencional seguida de sequenciamento para detecção e genotipagem de
amostras clínicas. Foi desenvolvida uma PCR em Tempo Real - ME para detectar,
quantificar e genotipar isolados de G. duodenalis diretamente de amostras de fezes.
Foram usadas 100 amostras clínicas (83 humanas e 17 caninas) positivas segundo
exame parasitológico e imunológico.
A N - PCR convencional - βg amplificou 61%
destas (52 amostras humanas e sete caninas) e todas foram caracterizadas como
genótipo A, sendo 42 subtipo A1 (38 humanas e quatro caninas) e 19 subtipo A2 (16
humanos e três caninas). A N - PCR convencional - ME detectou apenas nove
amostras (9%) positivas e todas pertencentes ao genótipo A, sendo seis humanas
(quatro pertencentes ao subtipo A1, uma subtipo A2 e uma com subtipo
indeterminado) e três caninas (todas A1). Ao correlacionar a genotipagem por
ambos marcadores, observou-se concordância na identificação do genótipo. A
comparação do limite de detecção da PCR convencional ME com a PCR em Tempo
Real - ME demonstrou que esta última foi aproximadamente 10 4 vezes mais
sensível. Análise estatística dos resultados obtidos com as réplicas da curva-padrão
indicou reprodutibilidade do método e determinou que amostras negativas são
aquelas com valores de Ct > 37. Desta forma, 71 amostras clínicas (71%) foram
positivas na PCR em Tempo Real - ME com sonda para subtipo A1, destas 62
(87,3%) eram amostras humanas e nove (13,4%) caninas. A quantificação relativa
de DNA de G. duodenalis nas amostras clínicas com a PCR em Tempo Real - ME,
demonstrou que a concentração de cistos nas amostras analisadas variou de 4,21
ng a 204 fg (respectivamente, 22.000 e 1,0 cistos). A PCR em Tempo Real - ME
apresentou maior sensibilidade em relação à N - PCR convencional - ME, indicando
a necessidade de utilização de novos iniciadores, pois os utilizados encontram-se
em regiões polimórficas, como demonstrado pela análise das sequências de ME.
Apesar da necessidade de mais estudos, os resultados obtidos neste trabalho
indicam que a PCR em Tempo Real - ME possui potencial aplicabilidade nos
estudos de epidemiologia molecular da giardíase.Giardia duodenalis (G. duodenalis) is an intestinal protozoan parasite found
worldwide in various mammalian hosts, including humans. G. duodenalis isolates
display high genetic diversity with seven genotypes (A-G) and subtypes. However,
only A and B assemblages have been detected in humans. The subtype A1 parasite
presents the strongest zoonotic potential. Discordant genotyping and detection
results of G. duodenalis isolates have been previously reported using amplicon
sequence analysis from certain molecular markers. Therefore, this leads to the
search of novel ones. The purpose of this work was to compare conventional PCR,
followed by sequencing, using malic enzyme (ME) and β-giardin gene (βg) as
molecular markers for the detection and genotyping of the parasite found in faecal
samples. Likewise, an approach involving Real Time PCR - ME for detecting,
quantifying and genotyping G. duodenalis isolates was developed. We collected 100
positive faecal samples (83 humans and 17 canines) according to parasitological
exam and immunoassays. N - PCR - βg detected 61 positive samples (61%) from
which 52 were human and seven were canine. All those samples were characterized
as genotype A. Subtype A1 and A2 were determined in 42 (38 humans/4 canines)
and 19 (16 humans/3 canines) samples, respectively. However N - PCR - ME
analyses revealed that only nine faecal samples (9%) were positive (6 humans/3
canines) for genotype A. Six human samples were subtyped as A1 (4), A2 (1) and
one not-determined, and the three canine samples were subtype A2. However, when
correlating the sample genotyping using both markers, we have observed an
agreement in the identification of the genotypes. The comparison of the detection
limit between the N - PCR - ME and the Real Time PCR - ME showed that the latter
one was approximately 104-fold more sensitive. The statistical analysis of the data
from the standard curve replicates indicated reproducibility of the method.
Furthermore, Ct values > 37 were established as an indicative for negative samples.
Therefore, Real Time PCR - ME analysis revealed that 71 samples (71%) were
positive for subtype A1 from which 62 (87.3%) and nine (13.4%) samples were
humans and canines, respectively. The relative quantification of G. duodenalis DNA
in the clinical samples using Real Time PCR - ME varied from 4.21 ng to 204.0 fg
corresponding to 22.000 and one cyst, respectively. Overall, Real Time PCR – ME
analysis showed to be more sensitive than N - PCR - ME. It, thus, suggest the need
to design different primers, because the ones used were within a polymorphic region
of the ME sequence. Although more investigation is yet to be done, the results
achieved in this work indicate that Real Time PCR - ME has a great potential in the
applicability for molecular epidemiological studies of giardiasis
Impacto dos Polimorfismos de Nucleotídeo Único (SNPs) nos genes humanos da interleucina 28B (IL28B) e da inosina trifosfato pirofosfatase (ITPA) sobre o tratamento da Hepatite C
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license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5)
Previous issue date: 2015Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, BrasilA infecção pelo vírus da hepatite C (HCV) representa um grave problema de saúde pública no Brasil e apesar dos recentes progressos, o tratamento ainda é um dos maiores desafios tanto em termos de efetividade clínica como de custo-benefício. A anemia hemolítica induzida pela ribavirina (RBV) é o principal efeito colateral no tratamento antiviral. Além dos fatores virais, fatores do hospedeiro têm papel fundamental no controle da infecção. Estudos recentes demonstraram que polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) nos genes da interleucina 28B (IL28B) estão fortemente associadas com a resolução espontânea (RE) da doença e com resposta virológica sustentada (RVS) e, no gene da inosina trifosfato pirofosfatase (ITPA) estão relacionados com a proteção contra a anemia. No gene IL28B, os genótipos CC no rs12979860, e TT no rs8099917 estão associados com a cura espontânea e com a resposta à terapia. No gene da ITPA, os genótipos CC no rs1127354 e AA no rs7270101 apresentam associação com a anemia. No entanto, a maioria dos métodos de identificação destes polimorfismos, atualmente disponíveis, é custosa. O objetivo geral deste trabalho foi determinar o perfil alélico dos genes IL28B e ITPA em amostras de pacientes com hepatite C, avaliar a associação dos polimorfismos do gene IL28B com resolução espontânea e terapêutica e, do gene da ITPA com a redução dos níveis de hemoglobina durante o tratamento antiviral. Neste trabalho, numa etapa inicial para o gene IL28B, quatro metodologias foram avaliadas em termos de especificidade, custo e tempo de execução: tetra-primer amplification-refractory mutation system-polymerase chain reaction (ARMS-PCR), polimorfismo no comprimento do fragmento de restrição (RFLP); reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) e sequenciamento nucleotídeo
Devido a próxima localização dos SNPs do gene ITPA, a genotipagem foi realizada por meio de sequenciamento nucleotídico. Um total de 281 amostras de sangue total de pacientes com infecção crônica pelo HCV foi estudado. Protocolos próprios para as técnicas ARMS-PCR e RFLP foram desenvolvidos e otimizados e, os resultados comparados com os do sequenciamento. Todos os métodos foram específicos, contudo o método ARMS-PCR apresentou os melhores resultados de acordo com a análise de custo-benefício. Em um segundo estudo, a frequência de polimorfismos do rs1127354 e rs7270101 do gene da ITPA foi avaliada em 200 pacientes com hepatite C crônica, e em 100 indivíduos saudáveis e, a associação com o desenvolvimento de anemia foi investigado em 97 pacientes que concluíram a terapia antiviral. A frequência global de distribuição alélica em rs7270101 e rs1127354 mostrou altas taxas dos genótipos AA (84,0%) e CC (94,3%), respectivamente, sugerindo que a coorte estudada possui uma grande propensão para o desenvolvimento de anemia induzida pela RBV. Ademais, constatamos uma diminuição progressiva de hemoglobina durante a terapia antiviral, sendo mais significante na 12ª semana e em pacientes do sexo masculino. No terceiro estudo, analisamos a associação entre os genótipos dos SNPs da IL28B com RE em 24 pacientes com hepatite aguda e em 111 pacientes crônicos com RVS tratados com PEG-IFN/RBV. O genótipo CC (rs12979860) e o genótipo TT (rs8099917) apresentaram associação com RE e o alelo C (rs12979860) apresentou forte associação (p=0,0045) com a RVS
Estes dados confirmaram a importância destes genótipos no controle da infecção. Os resultados obtidos neste trabalho são importantes para um melhor entendimento dos fatores do hospedeiro associados com a eliminação espontânea do vírus, com a RVS e com a anemia induzida pela ribavirina no tratamento antiviral da infecção pelo HCVHepatitis C virus (HCV)
i
nfection is a leading public health problem in Brazil
. D
espite
of
the
recent progress, the treatment is still a major challenge in terms of both clinical
-
and
cost
-
effectiveness. The
r
ibavirin
(RBV)
-
induced anemi
a
is the major
hematological
effect
of antiviral treatment. In addition to viral factors, the host factors play a fundamental role in
infection control
. Recent studies have shown that single nucleoti
de polymorphisms (SNPs)
in the
genes of interleukin 28B (
IL28B) and inosine triphosphate pyrophosphatase (ITPA)
are strongly associated with spontaneous
clearence
(
SC
) of the
virus,
with sustained
virologic response (SVR) and
with
protection against anemia. In the IL28B gene, the CC
genotype at rs12979860 and TT
genotype at rs8099917
are associated
with spontaneous
clearance of virus
and
with
response to therapy. In ITPA gene, CC genotype in rs1127354
and AA genotype at rs7270101
show association
with anemia. However, most of the
methods currently available
for i
dentifying these
polymorphisms
are
costly. The aim of this
study was to determine the allelic profile of IL28B and ITPA genes in samples from
patients with hepatitis C, evaluate the association of polymorphisms in IL28B gene
with
spontaneous and treatment
-
induced clearance of HCV
and
,
ITPA gene
, w
ith
development
of anemia
during antiviral therapy. In this work,
initially
for IL28 gene
, four techniques
were
evaluated in terms of specificity, cost and time of execution: tetra
-
primer amplification
refractory m
utation system
-
polymerase
-
chain reaction (ARMS
-
PCR), restriction fragment
length polymorphism (RFLP); chain reaction quantitative polymerase (qPCR) and direct
nucleotide sequencing
.
Due to SNPs
location
in ITPA gene, genotyping was performed by
nucleotide
sequencing.
A total of
281
whole blood
samples from patients with chronic HCV
infection w
ere
studi
ed. P
rotocols for ARMS
-
PCR and RFLP techniques
were
developed
and optimized and the results compared with
those of
sequencing. All methods were
specific; howe
ver, ARMS
-
PCR method showed the best results according to the cost
-
benefit analysis. In a second study, the frequency of rs1127354 and rs7270101
polymorphisms in ITPA gene was evaluated in 200 patients with chronic hepatitis C
, and in
100 healthy individua
ls, and the
association with the development of anemia was
investigated in 97 patients who completed the antiviral therapy. The overall allele
frequency distribution
at
rs7270101 and
at
rs1127354 showed high rates of AA genotypes
(84
.0
%) and CC genotypes
(
94.3%), respectively. These results
suggest
ed
that the cohort
has a high propensity for the development of
RBV
-
induced anemia
. Moreover, we
noticed
a progressive decrease in hemoglobin during antiviral therapy
,
more significant
ly
in the
12
th
weeks and in
male patients. In the third study, we analyzed the association between
the IL28B SNPs
with SC
in 24 patients with acute hepatitis and
in
111
chronic patients with
SVR
treated with PEG
-
IFN/
RBV. The CC genotype (rs12979860) and the TT genotype
(rs8099917) we
re associated with
SC
and the C allele (rs12979860) showed a strong
association (
p
= 0.0045) with the
S
VR
. The
data confirm the importance of these
genotypes in infection control. Th
ese results
are
also
important for a better understanding
of host factors
associated with spontaneous clearance of the virus, with SVR and with
RBV
-
induced anemia
in antiviral treatment
of HCV infectio