Reliability of human retina organoid generation from hiPSC-derived neuroepithelial cysts

The possible applications for human retinal organoids (HROs) derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSC) rely on the robustness and transferability of the methodology for their generation. Standardized strategies and parameters to effectively assess, compare, and optimize organoid protocols are starting to be established, but are not yet complete. To advance this, we explored the efficiency and reliability of a differentiation method, called CYST protocol, that facilitates retina generation by forming neuroepithelial cysts from hiPSC clusters. Here, we tested seven different hiPSC lines which reproducibly generated HROs. Histological and ultrastructural analyses indicate that HRO differentiation and maturation are regulated. The different hiPSC lines appeared to be a larger source of variance than experimental rounds. Although previous reports have shown that HROs in several other protocols contain a rather low number of cones, HROs from the CYST protocol are consistently richer in cones and with a comparable ratio of cones, rods, and Müller glia. To provide further insight into HRO cell composition, we studied single cell RNA sequencing data and applied CaSTLe, a transfer learning approach. Additionally, we devised a potential strategy to systematically evaluate different organoid protocols side-by-side through parallel differentiation from the same hiPSC batches: In an explorative study, the CYST protocol was compared to a conceptually different protocol based on the formation of cell aggregates from single hiPSCs. Comparing four hiPSC lines showed that both protocols reproduced key characteristics of retinal epithelial structure and cell composition, but the CYST protocol provided a higher HRO yield. So far, our data suggest that CYST-derived HROs remained stable up to at least day 200, while single hiPSC-derived HROs showed spontaneous pathologic changes by day 200. Overall, our data provide insights into the efficiency, reproducibility, and stability of the CYST protocol for generating HROs, which will be useful for further optimizing organoid systems, as well as for basic and translational research applications

Effect of Levofloxacin on HeLa- and PC 3-cells

Das Fluorchinolon Levofloxacin hemmt die Gyrase in Mitochondrien, wodurch die mitochondriale DNA in der supercoiled-Form repliziert wird. Dabei entstehen Katenate, die bei einer Zellteilung nur an ein Tochtermolekül weitergegeben werden. Dies hat zur Folge, dass Zellen ohne mtDNA, sogenannte ρ0-Zellen, entstehen. Diese Eigenschaft von Levofloxacin sollte genutzt werden, um ρ0-Zellen zweier Krebszelllinien (HeLa und PC 3) herzustellen. Zusätzlich wurde die Wirkung von Levofloxacin auf diese Krebszellen untersucht, um einen neuen möglichen Therapieansatz zu finden. Überprüft wurde dies mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie, einem metabolischen Test und einer relativen Quantifizierung mittels qPCR. Anhand der Ergebnisse konnten Unterschiede zwischen den beiden Zelllinien beobachtet werden. Levofloxacin bewirkte eine Proliferationshemmung und die Induzierung einer Apoptose bei höheren Konzentrationen, was eine toxische Wirkung auf die Krebszellen beweist. Es war jedoch nicht möglich, ρ0-Zellen herzustellen. Bei den HeLa-Zellen konnte eine Abnahme der mtDNA beobachtet werden, bei den PC 3-Zellen kam es dagegen zu einem Anstieg, was auf eine Überproduktion an mitochondrialer DNA zurückzuführen wäre. Die Herstellung von ρ0-HeLa-Zellen wäre mit Levofloxacin bei einer längeren Antibiotikabehandlung möglich