Effect of platelet-rich fibrin matrix in complex with artificial material Nubiplant on expression of chondrogenic marker genes and morphogenesis of the nucleus pulposus cells of intervertebral discs in rats

The purpose was to study the barrier and biological properties of platelet-rich fibrin matrix (PRFM), an artificial biopolymer Nubiplant, and a mixture of PRFM / Nubiplant by assessing the viability and morphological characteristics of nucleus pulposus (NP) cells in rats, as well as the expression level of chondrogenic marker genes during cell cultivation in the presence of these matrices.Materials and methods. PRFM was obtained from platelet-rich plasma using a SiO2 coagulation activator. A suspension of nucleus pulposus cells was obtained from the caudal spine of rats. Cultivation was carried out in the presence of one of three matrices — PRFM, Nubiplant, or their mixture for 3, 7, and 14 days under standard culture conditions in an EC-160 incubator (Nüve, Turkey). Observation of the living culture was carried out in the area bordering with the matrix within one field of view using an inverted microscope (Nicon TS100, Japan). The expression of chondrogenic marker genes in the cell culture of the NP was determined by the method of PCR with reverse transcription.Results. The study of the viability and morphological characteristics of NP cells during their cultivation for 3, 7, and 14 days in the presence of PRFM, PRFM / Nubiplant, or Nubiplant showed a decrease in the content of living cells in control samples; in cultures with PRFM and PRFM / Nubiplant, the number of living cells significantly exceeded the control values, aggregation of cells was observed in the area bordering with the matrices from the side of the application. None of the experimental samples showed the outflow of cells to the opposite side of the matrix after 14 days of cultivation; thus, PRFM, Nubiplant, and their mixture can perform barrier functions to keep the cell population in a certain location. Expression of the COL II, ACAN, GPC3, ANXA3, PTN, MGP, and VIM genes by the NP cells during cultivation for 3 and 7 days in the presence of PRFM and PRFM / Nubiplant increased as compared to the control samples.Conclusions. The use of PRFM, Nubiplant, or a mixture of PRFM / Nubiplant during the cultivation of NP cells demonstrated the absence of cell outflow to the opposite side of the studied matrices during the study period (14 days). The use of PRFM, Nubiplant, or a mixture of PRFM / Nubiplant promoted the formation of cell colonies with chondrocyte-like morphology in the zone bordering with the matrices and maintained cell viability throughout the study period. PRFM and PRFM / Nubiplant contributed to the maintenance of the expression of chondrogenic genes in the NP cells in the zone bordering the matrices. The results obtained indicate the positive effect of the matrix based on platelet-rich fibrin on the NP cells and its barrier functions, which is promising for the use of PRMF for preventing the formation of cicatricial adhesion

Особливості перебігу експериментального алергічного енцефаломієліту після трансплантації стовбурових клітин

The objective. To study the course of experimental allergic encephalomyelitis (EAE) after intravenous administration of hematopoietic stem cells (HSC) and suboccipital transplantation of fetal neurocells (FNC), and treatment impact on intensity of neural tissue renewing in rats with EAE.Materials and methods. The experiment included 40 rats, average weight 200 g. EAE was induced using complete Freund’s adjuvant. In 32 rats with EAE we used intravenous HSK (10 million cells or 20 million cells) and suboccipital transplantation of FNC (0.1 ml). The EAE clinical course was estimated up to 110 days. The rats were taken from the experiment on 23rd, 25th days and in 2 months after EAE induction. The preparations were stained by Nisse, with hematoxylin, eosin and picro-fuchsin. Morphological and morphometric studies were performed.Results. Complete recovery was not observed, and on the 26th day of the experiment EAE was regarded as a chronic process. After allogeneic HSC administration (in dose 10 million cells) peak of clinical manifestations was observed on the 20th day of the experiment with animals’ gradual complete recovery. Administration of allogeneic HSC in a dose of 20 million cells leads to significantly more rapid regression of clinical signs compared to the treatment with allogeneic HSC in a dose of 10 million cells. Animals’ recovery after intravenous introduction of HSC and suboccipital transplantation of FNC was significantly more rapid than after treatment just with HSC. The treatment with intravenous introduction of HSC (20 million cells) and suboccipital transplantation of FNC was associated with temporary significant deterioration after HSC administration and rapid recovery after FNC application (on the 29th day). In all treatment options we revealed the tendency to reduction of pathologically changed neurocyts and gliocyts number.Conclusion. Suboccipital administration of allogeneic FNC improves the clinical condition of rats with EAE. The best results of experimental EAE treatment were observed at intravenous administration of HSC (20 million cells) followed by FNC neurotransplantation, particularly on the 63rd day.Цель. Изучить течение экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЭАЭ) после внутривенного введения гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и субокципитальной нейротрансплантации фетальных нейроклеток (ФН), их влияние на интенсивность процессов восстановления нервной ткани крыс при ЭАЭ.Материалы и методы. Исследование проведено на 40 крысах, масса тела200 г. ЭАЭ моделировали с использованием полного адъюванта Фрейнда. В основной группе 32 крысам внутривенно вводили ГСК (10 млн. или 20 млн. клеток) и субокципитально 2 млн. ФН. Клиническое течение ЭАЭ оценивали в сроки до 110 сут. Животных выводили из эксперимента на 23-и, 35-е сутки и через 2 мес после моделирования ЭАЭ. Препараты окрашивали по Нисслю, гематоксилином и эозином, гематоксилином и пикрофуксином, проводили морфометрию.Результаты. В группе №1 (без введения ГСК и ФН) полное выздоровление животных не наблюдали, с 26-х суток течение ЭАЭ было хроническим. В группе №2 вводили ГСК в дозе 10 млн. клеток, пик клинических проявлений наблюдали на 20-е сутки с постепенным выздоровлением животных. В группе №3 введение 20 млн. ГСК статистически значимо способствовало более быстрому регрессу клинических проявлений по сравнению с такими в группе №2. Выздоровление животных, которым вводили ГСК и ФН, происходило статистически значимо быстрее, чем у животных, которым вводили только ГСК. В группе №5 (ГСК в дозе 20 млн. клеток с последующим интратекальным введением ФН) наблюдали временное статистически значимое ухудшение состояния животных после введения ГСК и быстрое улучшение состояния после введения ФН — на 29-е сутки. У всех крыс наблюдали тенденцию к уменьшению количества патологически измененных нейроцитов и уменьшение количества глиоцитов.Выводы. Наиболее выраженное позитивное влияние на течение заболевания, скорость восстановления клинического состояния животных и сохранность нейронов отмечены при внутривенном введении 20 млн. ГСК с последующим субокципитальным введением ФН, особенно на 63-и сутки наблюдения.Мета. Вивчити перебіг експериментального алергічного енцефаломієліту (ЕАЕ) після внутрішньовенного введення гемопоетичних стовбурових клітин (ГСК) та субокципітальної нейротрансплантації фетальних нейроклітин (ФН), їх вплив на інтенсивність процесів відновлення нервової тканини у щурів при ЕАЕ.Матеріали і методи. Дослідження проведене на 40 щурах, маса тіла200 г. ЕАЕ моделювали з використанням повного ад’юванта Фрейнда. В основній групі 32 щурам внутрішньовенно вводили ГСК (10 млн. чи 20 млн. клітин) та субокципітально ФН (2 млн.). Клінічний перебіг ЕАЕ оцінювали в період до 110 діб. Тварин виводили з експерименту через 23, 35 діб та 2 міс після моделювання ЕАЕ. Препарати забарвлювали за Нісслем, гематоксиліном та еозином, гематоксиліном та пікрофуксином, проводили морфометрію.Результати. У групі №1 (без введення ГСК та ФН) одужання тварин не спостерігали, з 26-ї доби відзначений хронічний перебіг ЕАЕ. Тваринам групи №2 вводили ГСК у дозі 10 млн. клітин, пік клінічних проявів ЕАЕ спостерігали на 20-ту добу з поступовим одужанням тварин. У щурів групи №3 введення ГСК у дозі 20 млн. клітин статистично значуще сприяло швидшому регресу клінічних проявів у порівнянні з таким в групі №2. Одужання тварин, яким водили ГСК і ФН, відбувалося статистично значуще швидше ніж тварин, у яких застосовували лише ГСК. У щурів групи №5 (ГСК у дозі 20 млн. клітин з подальшим інтратекальним введенням ФН) спостерігали тимчасове статистично значуще погіршення стану після введення ГСК та швидке покращення стану після введення ФН — на 29-ту добу. В усіх тварин спостерігали тенденцію до зменшення кількості патологічно змінених нейроцитів та кількості гліоцитів.Висновки. Найбільш виражений позитивний вплив на перебіг захворювання, швидкість відновлення клінічного стану тварин і збереження нейронів відзначали при внутрішньовенному введенні 20 млн. ГСК з подальшим субокципітальним введенням ФН, особливо на 63-тю добу спостереження

Вплив збагаченого тромбоцитами фібринового матриксу в комплексі зі штучним матеріалом Nubiplant на експресію хондрогенних маркерних генів та морфогенез клітин пульпозного ядра міжхребцевих дисків щурів

The purpose was to study the barrier and biological properties of platelet-rich fibrin matrix (PRFM), an artificial biopolymer Nubiplant, and a mixture of PRFM / Nubiplant by assessing the viability and morphological characteristics of nucleus pulposus (NP) cells in rats, as well as the expression level of chondrogenic marker genes during cell cultivation in the presence of these matrices.Materials and methods. PRFM was obtained from platelet-rich plasma using a SiO2 coagulation activator. A suspension of nucleus pulposus cells was obtained from the caudal spine of rats. Cultivation was carried out in the presence of one of three matrices — PRFM, Nubiplant, or their mixture for 3, 7, and 14 days under standard culture conditions in an EC-160 incubator (Nüve, Turkey). Observation of the living culture was carried out in the area bordering with the matrix within one field of view using an inverted microscope (Nicon TS100, Japan). The expression of chondrogenic marker genes in the cell culture of the NP was determined by the method of PCR with reverse transcription.Results. The study of the viability and morphological characteristics of NP cells during their cultivation for 3, 7, and 14 days in the presence of PRFM, PRFM / Nubiplant, or Nubiplant showed a decrease in the content of living cells in control samples; in cultures with PRFM and PRFM / Nubiplant, the number of living cells significantly exceeded the control values, aggregation of cells was observed in the area bordering with the matrices from the side of the application. None of the experimental samples showed the outflow of cells to the opposite side of the matrix after 14 days of cultivation; thus, PRFM, Nubiplant, and their mixture can perform barrier functions to keep the cell population in a certain location. Expression of the COL II, ACAN, GPC3, ANXA3, PTN, MGP, and VIM genes by the NP cells during cultivation for 3 and 7 days in the presence of PRFM and PRFM / Nubiplant increased as compared to the control samples.Conclusions. The use of PRFM, Nubiplant, or a mixture of PRFM / Nubiplant during the cultivation of NP cells demonstrated the absence of cell outflow to the opposite side of the studied matrices during the study period (14 days). The use of PRFM, Nubiplant, or a mixture of PRFM / Nubiplant promoted the formation of cell colonies with chondrocyte-like morphology in the zone bordering with the matrices and maintained cell viability throughout the study period. PRFM and PRFM / Nubiplant contributed to the maintenance of the expression of chondrogenic genes in the NP cells in the zone bordering the matrices. The results obtained indicate the positive effect of the matrix based on platelet-rich fibrin on the NP cells and its barrier functions, which is promising for the use of PRMF for preventing the formation of cicatricial adhesion.Цель: исследовать барьерные и биологические свойства обогащенного тромбоцитами фибринового матрикса (ОТФМ), искусственного биополимера Nubiplant и смеси ОТФМ и Nubiplant путем оценки жизнеспособности и морфологических характеристик клеток пульпозного ядра (ПЯ) межпозвоночных дисков крыс, а также уровня экспрессии хондрогенных маркерных генов при культивировании этих клеток при наличии указанных матриксов.Материалы и методы. ОТФМ получали из обогащенной тромбоцитами плазмы с использованием активатора свертывания SiO2, суспензию клеток ПЯ ‒ из хвостового отдела позвоночника крыс. Культивирование осуществляли при наличии одного из трех матриксов ‒ ОТФМ, Nubiplant или их смеси в течение 3, 7 и 14 суток при стандартных культуральных условиях в инкубаторе ЕС-160 (Nüve, Турция). Наблюдение за живой культурой проводили в пограничной с матриксом зоне в пределах одного поля зрения с использованием инвертированного микроскопа (Nicon TS100, Япония). Экспрессию хондрогенных маркерных генов в культуре клеток ПЯ определяли методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.Результаты. Исследование жизнеспособности и морфологических характеристик клеток ПЯ при их культивировании продемонстрировало снижение содержания живых клеток в контрольных образцах. В культурах с ОТФМ и смесью ОТФМ и Nubiplant количество живых клеток статистически значимо превышало контрольные показатели. Наблюдали агрегацию клеток в пограничной с матриксами зоне со стороны нанесения. Выселения клеток на противоположную сторону матрикса в течение 14 суток ни в одном из экспериментальных образцов не отмечено. Таким образом, ОТФМ, Nubiplant и их смесь могут выполнять барьерные функции по удержанию клеточной популяции в определенном участке. Экспрессия генов COL II, ACAN, GPC3, ANXA3, PTN, MGP и VIM клетками ПЯ при культивировании в течение 3 и 7 суток при наличии ОТФМ и смеси ОТФМ и Nubiplant возрастала по сравнению с контрольными образцами.Выводы. Применение ОТФМ, Nubiplant или смеси ОТФМ и Nubiplant при культивировании клеток ПЯ продемонстрировало отсутствие выселения клеток на противоположную сторону упомянутых матриксов в течение всего периода исследования (14 дней). Использование ОТФМ, Nubiplant или смеси ОТФМ и Nubiplant способствовало формированию колоний клеток хондроцитоподобной морфологии в пограничной с матриксами зоне и поддерживало жизнеспособность клеток в течение всего исследуемого периода. Применение ОТФМ и ОТФМ и Nubiplant позволяло поддерживать экспрессию хондрогенных генов клетками ПЯ в пограничной с матриксами зоне. Полученные результаты свидетельствуют о положительном действии матрикса на основе обогащенного тромбоцитами фибрина на клетки ПЯ и его барьерные функции, что является перспективным для применения ОТФМ с целью предотвращения формирования рубцово-спаечных процессов.Мета: дослідити бар’єрні та біологічні властивості збагаченого тромбоцитами фібринового матриксу (ЗТФМ), штучного біополімеру Nubiplant та їх суміші шляхом оцінки життєздатності та морфологічних характеристик клітин пульпозного ядра (ПЯ) міжхребцевих дисків щурів, а також рівня експресії хондрогенних маркерних генів при культивуванні цих клітин за наявності зазначених матриксів.Матеріали і методи. ЗТФМ отримували зі збагаченої тромбоцитами плазми з використанням активатора згортання SiO2, суспензію клітин ПЯ ‒ із хвостового відділу хребта щурів. Культивування здійснювали за наявності одного з трьох матриксів – ЗТФМ, Nubiplan або їх суміші протягом 3, 7 та 14 діб за стандартних культуральних умов в інкубаторі ЕС-160 (Nüve, Турція). Спостереження за живою культурою проводили в пограничній з матриксами зоні в межах одного поля зору з використанням інвертованого мікроскопа (Nicon TS100, Японія). Експресію хондрогенних маркерних генів у культурі клітин ПЯ визначали методом полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскрипцією.Результати. Дослідження життєздатності та морфологічних характеристик клітин ПЯ при їх культивуванні продемонструвало зниження вмісту живих клітин у контрольних зразках. У культурах із ЗТФМ та сумішшю ЗТФМ і Nubiplant кількість живих клітин статистично значущо перевищувала контрольні показники. Спостерігали агрегацію клітин у зоні безпосереднього межування з матриксами з боку нанесення. Виселення клітин на протилежний бік матриксу протягом 14 діб у жодному з експериментальних зразків не відзначено. Таким чином, ЗТФМ, Nubiplant та їх суміш можуть виконувати бар’єрні функції щодо утримання клітинної популяції в певній ділянці. Експресія генів COL II, ACAN, GPC3, ANXA3, PTN, MGP та VIM клітинами ПЯ при культивуванні протягом 3 та 7 діб за наявності ЗТФМ і суміші ЗТФМ та Nubiplant зростала порівняно з контрольними зразками.Висновки. Застосування ЗТФМ, Nubiplant або суміші ЗТФМ і Nubiplant при культивуванні клітин ПЯ продемонструвало відсутність виселення клітин на протилежний бік зазначених матриксів протягом усього періоду дослідження (14 діб). Використання ЗТФМ, Nubiplant або суміші ЗТФМ і Nubiplant сприяло формуванню колоній клітин хондроцитоподібної морфології у зоні межування з матриксами та підтримувало життєздатність клітин протягом усього досліджуваного періоду. Застосування ЗТФМ і суміші ЗТФМ та Nubiplant давало змогу підтримувати експресію хондрогенних генів клітинами ПЯ в пограничній з матриксами зоні. Отримані результати свідчать про позитивну дію матриксів на основі збагаченого тромбоцитами фібрину на клітини ПЯ та його бар’єрні функції, що є перспективним для застосування ЗТФМ з метою запобігання формуванню рубцево-спайкових процесів