Estudio de los efectos de un microambiente hipóxico en queratinocitos humanos in vitro y su correlato con alteraciones del microambiente en la patología de liquen plano oral

La hipoxia es un factor fundamental en el proceso de génesis tumoral, así como en patologías precursoras de cáncer, como es el Liquen Plano Oral (LPO). Objetivo: Determinar si es posible establecer una correlación entre las alteraciones que sufren queratinocitos normales en un microambiente hipóxico in vitro y alteraciones que aparecen en los queratinocitos en el epitelio de la mucosa oral en el contexto de la patología LPO. Métodos: Se estudiaron los cambios morfológicos mediante microscopía de contraste de fases, y la detección de marcadores asociados a hipoxia de queratinocitos humanos (HaCaT), como modelo celular oral, en un microambiente hipóxico generado por la variante del método “Hipoxia inducida por cubreobjetos”. Resultados: Mediante microscopía confocal se observó la presencia de los marcadores de hipoxia GLUT-1 y aductos de pimonidazol (Hipoxyprobe) en los cultivos celulares de HaCaT expuestos a un microambiente hipóxico. Además, se observó la presencia del marcador GLUT-1 mediante inmunohistoquímica en tejido epitelial humano derivado de biopsias de la patología LPO. Conclusiones: Se estableció una correlación entre las alteraciones detectadas en queratinocitos humanos inducidos a un microambiente hipóxico in vitro y las alteraciones detectadas in vivo en tejido epitelial de la mucosa oral

Estudio de la hipoxia, la acidificación y el estrés oxidativo en un modelo de microambiente tumoral in vitro en queratinocitos transducidos con los oncogenes virales del HPV-18

Durante el desarrollo tumoral inicial, las células deben adaptarse a un microambiente hipóxico, afrontando adaptaciones al estrés causado por la hipoxia, que además de la falta de oxígeno conlleva asimismo el aumento de la acidificación y del estrés oxidativo, con profundas consecuencias para la fisiología celular y la evolución futura del tumor. Por lo tanto, la interacción entre la hipoxia y el estrés oxidativo es un aspecto importante para comprender los efectos del microambiente hipóxico en las células. En trabajos previos, a partir de queratinocitos humanos de la línea celular no tumoral HaCaT, se han generado células que expresan establemente los oncogenes E5, E6 Y E7 del virus HPV-18 (HaCaT E5/E6/E7-18), muy asociados a cánceres de alta prevalencia, como el cáncer de cuello de útero y el carcinoma oral. Las células HaCaT E5/E6/E7-18 así obtenidas representan un modelo celular muy útil para estudiar etapas tempranas del desarrollo tumoral. Por otra parte, se ha utilizado una variante del método de hipoxia inducida por cubreobjetos, desarrollada previamente, que permite recapitular los gradientes de hipoxia in vitro del microambiente tumoral temprano. De esta forma, se pudo estudiar el proceso de acidificación de las células HaCaT E5/E6/E7-18 en un microambiente hipóxico y visualizar, simultáneamente, los niveles intracelulares de hipoxia y estrés oxidativo de las mismas. Se observó una alta acumulación de CO2 en condiciones hipóxicas, que es el principal contribuyente a la acidificación en el modelo utilizado. Además, se observaron mayores niveles de especies reactivas del oxígeno en células moderadamente hipóxicas cercanas a la fuente de oxígeno, donde se conservó el potencial de la membrana mitocondrial. Por el contrario, las células a grandes distancias de la fuente de oxígeno mostraron niveles más altos de hipoxia, menor nivel de especies reactivas del oxígeno y un potencial de membrana mitocondrial reducido. Estos resultados contribuyen a caracterizar la interacción entre los niveles reducidos de oxígeno, la acidificación y el estrés oxidativo en un entorno in vitro simple, que se puede utilizar para modelar las respuestas celulares a un ambiente alterado, como el microambiente tumoral temprano.Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA), Comisión Sectorial de Investigación Científica, Agencia Nacional de Investigación e Innovación1. Introducción 1. 1. Cáncer y carcinogénesis 1.2. Microambiente tumoral 1.3. Hipoxia, estrés oxidativo y algunos aspectos del metabolismo en el cáncer 1.4. Método de inducción de hipoxia 1.5. HPV y cáncer 1.6. Modelo celular utilizado y oncogenes del HPV 2. Hipótesis del trabajo 3. Objetivos 3.1. Objetivo general 3.2. Objetivos específicos 4. Materiales y métodos 4.1. Líneas y cultivos celulares 4.2. Hipoxia inducida por cubreobjetos 4.3. Cambios morfológicos en un microambiente hipóxico 4.4. Detección de hipoxia 4.5. Detección simultánea de hipoxia y ROS 4.6. Detección de potencial mitocondrial y superóxido 4.7. Medición de parámetros metabólicos relacionados al metabolismo glucolítico 4.8. Medidas de velocidad del consumo de oxígeno y acidificación extracelular 4.9. Análisis estadístico 5. Resultados 5.1. Cambios morfológicos en un microambiente hipóxico 5.2. Hipoxia intracelular inducida por cubreobjetos 5.3. Detección simultánea de hipoxia y estrés oxidativo 5.4. Detección simultánea de hipoxia y potencial de membrana mitocondrial 5.5. Estudio de parámetros metabólicos 6. Discusión 7. Conclusione

Estudio de los efectos de un microambiente hipóxico en queratinocitos humanos in vitro y su correlato con alteraciones del microambiente en la patología de liquen plano oral

La hipoxia es un factor fundamental en el proceso de génesis tumoral, así como en patologías precursoras de cáncer, como es el Liquen Plano Oral (LPO).  Objetivo: Determinar si es posible establecer una correlación entre las alteraciones que sufren queratinocitos normales en un microambiente hipóxico in vitro y alteraciones que aparecen en los queratinocitos en el epitelio de la mucosa oral en el contexto de la patología LPO.  Métodos: Se estudiaron los cambios morfológicos mediante microscopía de contraste de fases, y la detección de marcadores asociados a hipoxia de queratinocitos humanos (HaCaT), como modelo celular oral, en un microambiente hipóxico generado por la variante del método “Hipoxia inducida por cubreobjetos”.  Resultados: Mediante microscopía confocal se observó la presencia de los marcadores de hipoxia GLUT-1 y aductos de pimonidazol (Hipoxyprobe) en los cultivos celulares de HaCaT expuestos a un microambiente hipóxico. Además, se observó la presencia del marcador GLUT-1 mediante inmunohistoquímica en tejido epitelial humano derivado de biopsias de la patología LPO.  Conclusiones: Se estableció una correlación entre las alteraciones detectadas en queratinocitos humanos inducidos a un microambiente hipóxico in vitro y las alteraciones detectadas in vivo en tejido epitelial de la mucosa oral

Estudio de estrés celular y metabolismo en un modelo de microambiente tumoral in vitro en cáncer oral

Objetivos. El microambiente tumoral temprano es determinante para la evolución tumoral. Para estudiar in vitro la progresión tumoral, necesitamos desarrollar modelos que recapitulen las propiedades del microambiente tumoral. Una de las principales características de dicho microambiente es la falta de oxígeno. En este estudio, hemos usado un modelo de microambiente hipóxico que hemos desarrollado previamente, con el objetivo de estudiar los efectos de este microambiente en células HaCaT que expresan los oncogenes del HPV-18, y que pueden usarse como modelo de una etapa intermedia de la carcinogénesis oral. Métodos. Utilizamos la variante que desarrollamos del método de hipoxia inducida por cubreobjetos para generar un microambiente tumoral temprano in vitro. Visualizamos hipoxia y estrés oxidativo con sondas fluorescentes específicas. Por otra parte realizamos medidas de parámetros bioquímicos del microambiente tumoral mediante un radiómetro ABL800 Flex, y también medimos parámetros metabólicos de las células HaCaT control y con oncogenes virales mediante el analizador de flujo metabólico Seahorse XF24. Resultados. Observamos niveles de estrés oxidativo cambiantes de acuerdo al nivel de hipoxia registrado. También observamos que en condiciones de hipoxia ocurre una dismin ución de pH y un aumento en la presión de CO2 en relación a la normoxia. Asimismo, observamos diferencias en parámetros metabólicos entre HaCaT con oncogenes y HaCaT control. Conclusiones. Nuestros resultados indican que un modelo de microambiente tumoral in vitro produce estrés hipóxico y oxidativo,y que está acompañado de cambios en varios parámetros ambientales, que en conjunto pueden tener una profunda influencia en el proceso de carcinogénesis oral

Perfil mecánico de queratinocitos humanos que expresan oncogenes del HPV-18 para caracterizar cambios mecánicos en etapas intermedias de la carcinogénesis oral

OBJETIVOS. Las propiedades mecánicas de las células sufren cambios profundos durante el proceso de tumorigénesis, y son determinantes para comportamientos tumorales tales como la invasión y la metástasis. Nuestro objetivo es estudiar los cambios mecánicos que ocurren en etapas intermedias de este proceso, así como los cambios de morfología celular que frecuentemente acompañan a las alteraciones en el fenotipo mecánico. Para ello, utilizamos queratinocitos humanos (línea celular HaCaT, usada frecuentemente en estudios de biología oral) que expresan los oncogenes del HPV -18, y que constituyen entonces un modelo de etapa intermedia en el proceso de tumorigénesis oral. MÉTODOS. Utilizamos microscopía de fuerza atómica en el modo de nanoindentación y en el modo de mapeo nanomecánico cuantitativo para obtener medidas del módulo de Young y mapas mecánicos de la superficie celular, respectivamente. Además, utilizamos microscopía confocal para obtener parámetros morfológicos celulares. RESULTADOS. Observamos una disminución significativa en el módulo de Young en células HaCaT que expresan los oncogenes del HPV-18, y una disminución de la rigidez en las zonas de contacto célula célula. Por otra parte, la morfología celular se vuelve significativamente más redondeada en las células HaCaT que expresan los oncogenes del HPV-18. CONCLUSIONES. Nuestros resultados apoyan la hipótesis de que la disminución en la rigidez celular es un cambio mecánico que ocurre en etapas tempranas de la tumorigénesis oral, y que puede estar acompañado de cambios en la morfología celula