A Genotypic-oriented View of CFTR Genetics Highlights Specific Mutational Patterns Underlying Clinical Macro-categories of Cystic Fibrosis.

Cystic Fibrosis (CF) is a monogenic disease caused by mutations of the Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) gene. The genotype-phenotype relationship in this disease is still unclear, and diagnostic, prognostic and therapeutic challenges persist. We enrolled 610 patients with different forms of CF and studied them from a clinical, biochemical, microbiological and genetic point of view. Overall, 125 different mutated alleles (11 of which with novel mutations and 10 of which complex) and 225 genotypes were found. A strong correlation between mutational patterns at the genotypic level and phenotypic macro-categories emerged. This specificity appears to be largely dependent on rare and individual mutations, as well as on the varying prevalence of common alleles in different clinical macro-categories. However, 19 genotypes appeared to underlie different clinical forms of the disease. The dissection of the pathway from the CFTR mutated genotype to the clinical phenotype allowed to identify at least two components of the variability usually found in the genotype - phenotype relationship. One component seems to depend on the genetic variation of CFTR, the other component on the cumulative effect of variations in other genes and cellular pathways independent from CFTR. The experimental dissection of the overall biological CFTR pathway appears to be a powerful approach for a better comprehension of the genotype - phenotype relationship. However, a change from an allele-oriented to a genotypic-oriented view of CFTR genetics is mandatory, as well as a better assessment of sources of variability within the CFTR pathway

Il pattern mutazionale del gene CFTR in diverse forme di fibrosi cistica influenza le caratteristiche operative del test genetico

La Fibrosi Cistica ( FC; OMIM 219700) può originare da oltre 1800 diverse variazioni di sequenza del gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Le manifestazioni cliniche sono estremamente variabili, con una relazione tra genotipo e fenotipo spesso poco chiara. L a ricerca mutazionale non è inoltre sempre in grado di rilevare tutte le mutazioni presenti. L'obiettivo specifico di questo lavoro è valutare se le caratteristiche operative del test genetico per FC siano influenzate dalla metodologia di indagine mutazionale eventualmente applicata a diverse forme cliniche di FC. Abbiamo studiato 610 pazienti classificati in 4 popolazioni: 1) FC con insufficienza pancreatica (FC-PI, 354 pazienti); 2) FC con sufficienza pancreatica (FC-PS, 138 pazienti); 3) forme atipiche e/o mono- od oligo-sintomatiche di FC (nel complesso identificate come CFTR-RD, 71 pazienti); 4) assenza bilaterale congenita dei vasi deferenti, quale unica manifestazione clinica monosintomatica (CBAVD, 47 pazienti). La ricerca mutazionale nel CFTR è stata condotta con un approccio multistep volto all'analisi: a) delle 32 mutazioni più frequenti al mondo (saggio CF-OLA, Abbott); b) delle 14 mutazioni più frequenti nell'area geografica specifica (mediante un nostro saggio di primer extension); c) del tratto variante (TG)mTn (mediante un nostro saggio di sequenziamento); d) della regione 5'-prossimale, di tutti gli esoni e delle zone introniche adiacenti (mediante un nostro saggio di sequenziamento); e) delle 7 macro-delezioni più frequenti al mondo (saggio FC-DEL, Nuclear Laser Medicine). Abbiamo evidenziato 125 diversi alleli mutati (tra i quali 11 nuovi e 10 complessi con più di una mutazione in cis), suddivisi in 225 diversi genotipi. Sono state riscontrate differenze significative (chi-quadrato, p<0.0001) tra i pattem mutazionali delle 4 popolazioni analizzate. Questa eterogeneità influenza la detection rate (DR) sia allelica (DRa = proporzione di alleli mutati identificati) che genotipica (DRe = proporzione di genotipi completamente caratterizzati con 2 alleli mutati) dei singoli step della ricerca mutazionale. Ad esempio, gli step di ricerca di pannelli mutazionali (a+b) risultano avere, da soli, un'elevata DRa in FC-PI (0.890), un valore intermedio in FC-PS (0.725), ma valori piuttosto bassi di DRa in CFTR-RD (0.535) e CBAVD (0.255). Aggiungendo gli altri step di ricerca mutazionale (c+d+e) si ottiene un notevole incremento nella DRa in FC-PI (0.993), FC-PS (0.967) e CFTR-RD (0.965), ma un valore di DRa totale comunque limitato in CBAVD (0.564). Non risulta possibile individuare un unico pannello mutazionale che massimizzi la DRa in tutte le popolazioni. Inoltre, solo per la popolazione CF-PI appare possibile individuare un pannello con un numero limitato di mutazioni ed elevata DR. Per ottenere un'elevata DR nelle altre popolazioni è necessaria l'indagine di un elevato numero di mutazioni, anche rare e/o individuali. Oltre a ciò, 19 diversi genotipi mutati sono stati trovati in almeno 2 diverse popolazioni, evidenziando la complessità del rapporto tra genotipo e fenotipo. Questi risultati hanno importanti ricadute sull'organizzazione e interpretazione del test genetico in FC, in particolare per il test del portatore, nonché per la comprensione della relazione tra genotipo e fenotipo

The Ankylosing Spondylitis-Associated HLA-B*2705 Presents a B*0702-Restricted EBV Epitope and Sustains the Clonal Amplification of Cytotoxic T Cells in Patients

Abstract HLA-B*27 is strongly associated with an inflammatory autoimmune disorder, the Ankylosing Spondylitis (AS) and plays a protective role in viral infections. The two aspects might be linked. In this work, we compared in B*2705/B*07 positive patients with AS, the CD8+ T cell responses to two immunodominant EBV-derived epitopes restricted for either the HLA-B*27 (pEBNA3C) or the HLA-B*07 (pEBNA3A). We have unexpectedly found that the HLA-B*07-restricted EBNA3A peptide is presented by both the B*0702 and the B*2705 but not by the non AS-associated B*2709, that differs from the AS-associated B*2705 for a single amino acid in the peptide-binding groove (His116Asp). We then analyzed 38 B*2705-positive/B*07-negative (31 AS-patients and 7 healthy donors) and 8 B*2709-positive/B*07-negative subjects. EBNA3A-specific CD8+ T lymphocytes were present in 55.3% of the HLA-B*2705 but in none of the B*2709 donors (p = 0.0049). TCR β-chain analysis identified common TCRBV and TCRBJ gene segments and shared CDR3β sequences in pEBNA3A-responsive CTLs of B*2705 carriers, suggesting the existence of a shared TCR repertoire for recognition of the uncanonical B*2705/pEBNA3A complex. These data highlight the plasticity of the AS-associated HLA-B*2705, which presents peptides with suboptimal binding motifs, possibly contributing both to its enhanced capacity to protect against pathogens and to predispose to autoimmunity