Entwicklung von auf nanoporösen Silica-Nanopartikeln basierenden Implantat-assoziierten Freisetzungssystemen für Wachstumsfaktoren

Von genetischen Defekten und infektiösen Erkrankungen bis hin zu Alter und Umwelteinflüssen können verschiedene Ursachen den Einsatz von Implantaten erforderlich machen. Durch eine Implantation erhoffen sich betroffene Patienten eine Verbesserung der Lebensqualität, indem die ausgefallene Körperfunktion bestmöglich ersetzt wird. Somit ist die stetige Weiterentwicklung und Optimierung von Implantaten von großer Bedeutung. Diese kann beispielsweise durch die Entwicklung von neuen potentiellen Implantatmaterialien oder durch die Funktionalisierung der Implantatoberflächen - auf physikalischem, chemischem, biochemischem oder biologischem Weg - erfolgen. Im Fokus der vorliegenden Dissertation steht die biochemische Funktionalisierung von Implantaten, indem Implantat-assoziierte Freisetzungssysteme auf Basis von nanoporösen Silica-Nanopartikeln (NPSNPs) für die Wachstumsfaktoren brain-derived neurotrophic factor (BDNF) und transforming growth factor-β3 (TGF-β3) entwickelt werden. Ihre Anwendung sollen die zu entwickelnden Freisetzungssysteme auf der Oberfläche der Cochlea-Elektrode (BDNF) bzw. auf einem gradierten Implantat (TGF-β3) für die Regeneration des Sehnen-Knochen-Übergangs finden. Die durch eine Tensid-gesteuerte Synthese hergestellten NPSNPs wurden an ihrer Oberfläche mittels der post-grafting-Methode mit unterschiedlichen funktionellen Gruppen ausgestattet, um die Immobilisierungsmenge und die Freisetzung der Wachstumsfaktoren gezielt zu steuern. Aufgrund der großen Oberfläche konnte die gesamte eingesetzte Menge des jeweiligen Proteins unabhängig von der Modifizierung auf der Oberfläche der Nanopartikel immobilisiert werden. Bei den Freisetzungsexperimenten ließen sich dagegen, in Abhängigkeit von der Modifizierung, unterschiedliche Freisetzungskinetiken beobachten. Vor allem hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den Wachstumsfaktoren und der Nanopartikeloberfläche begünstigten eine kontinuierliche und langfristige Freisetzung. Neben den Wechselwirkungen hatte die unterschiedliche Stabilität der Proteine über den Freisetzungsverlauf einen entscheidenden Einfluss auf die freigesetzte Menge an aktivem Wachstumsfaktor. In Hinblick auf die angestrebten Anwendungen lieferten in vitro-Untersuchungen der beiden Freisetzungssysteme vielversprechende Ergebnisse. Die aus amino-modifizierten NPSNPs freigesetzten BDNF-Mengen übten einen starken neuroprotektiven und einen geringen neuroregenerativen Effekt auf die Spiralganglienneurone aus. Auch konnten die aus un- und amino-modifizierten NPSNPs freigesetzten TGF-β3-Mengen die chondrogene Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen anregen; in geringerem Maße galt dies auch für die aus Fasermatten aus Polycaprolacton freigesetzten TGF-β3-Mengen; diese Fasermatten waren zuvor mit TGF-β3-beladenen NPSNPs funktionalisiert worden. Somit wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei Freisetzungssysteme explizit für die gewünschten Anforderungen entwickelt und zusätzlich ein generelles Wissen bezüglich der Verwendung der NPSNPs als Freisetzungssysteme für Wachstumsfaktoren generiert

Long-term delivery of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) from nanoporous silica nanoparticles improves the survival of spiral ganglion neurons in vitro.

Sensorineural hearing loss (SNHL) can be overcome by electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) via a cochlear implant (CI). Restricted CI performance results from the spatial gap between the SGNs and the electrode, but the efficacy of CI is also limited by the degeneration of SGNs as one consequence of SHNL. In the healthy cochlea, the survival of SGNs is assured by endogenous neurotrophic support. Several applications of exogenous neurotrophic supply have been shown to reduce SGN degeneration in vitro and in vivo. In the present study, nanoporous silica nanoparticles (NPSNPs), with an approximate diameter of <100 nm, were loaded with the brain-derived neurotrophic factor (BDNF) to test their efficacy as long-term delivery system for neurotrophins. The neurotrophic factor was released constantly from the NPSNPs over a release period of 80 days when the surface of the nanoparticles had been modified with amino groups. Cell culture investigations with NIH3T3 fibroblasts attest a good general cytocompatibility of the NPSNPs. In vitro experiments with SGNs indicate a significantly higher survival rate of SGNs in cell cultures that contained BDNF-loaded nanoparticles compared to the control culture with unloaded NPSNPs (p<0.001). Importantly, also the amounts of BDNF released up to a time period of 39 days increased the survival rate of SGNs. Thus, NPSNPs carrying BDNF are suitable for the treatment of inner ear disease and for the protection and the support of SGNs. Their nanoscale nature and the fact that a direct contact of the nanoparticles and the SGNs is not necessary for neuroprotective effects, should allow for the facile preparation of nanocomposites, e.g., with biocompatible polymers, to install coatings on implants for the realization of implant-based growth factor delivery systems

Quantification of the amount of immobilized BDNF on unmodified and amino-modified NPSNPs which were incubated in a solution containing 1 μg mL^-1 BDNF.

<p>Quantification of the amount of immobilized BDNF on unmodified and amino-modified NPSNPs which were incubated in a solution containing 1 μg mL^-1 BDNF.</p

Neurite length of SGNs cultivated with BDNF-loaded (dark grey) and BDNF-free NPSNPs with (light grey, striped) or without (light grey) an additional exogenous BDNF supply.

<p>Values are given as mean ± standard error of the mean (<i>N</i> = 2, <i>n</i> = 3). Statistical assessment was performed using one-way ANOVA with Bonferroni´s multiple comparison test (n.s. = not significant, *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001). Asterisks over the bars indicate the significance of the survival rates of the different conditions compared to the medium control (serum-free SGC medium).</p

BDNF release profile of amino-modified NPSNPs in PBS (0.1% BSA) over 80 days at 37°C.

<p>The left axis represents the cumulative BDNF release with regard to 1 mg of nanoparticles and the right axis shows the cumulative release of BDNF referred to 1 mL release medium.</p

Microscopic images of spiral ganglion cells (SGCs) after two days of cultivation in different media composition.

<p>The cells were cultivated in presence of the supernatants from the release experiments of BDNF-loaded amino-modified NPSNPs (NPSNP-NH₂-BDNF) or of BDNF-free amino-modified NPSNPs (NPSNP-NH₂). For comparison, SGCs were also cultivated in serum-free SGC medium (medium) and in serum-free medium supplemented with BDNF (50 ng mL^-1 BDNF) as well as in a 1:1 serum-free medium/PBS (0.1% BSA) solution.</p

Relative cell viabilities of NIH3T3 fibroblasts in the presence of unmodified and amino-modified nanoparticles in different concentrations determined by the NRU assay after an incubation for four days.

<p>Values are given as mean ± standard error of the mean (<i>n</i> = 3).</p

BDNF release profile of unmodified NPSNPs in PBS (0.1% BSA) over 60 days at 37°C.

<p>The left axis represents the cumulative BDNF release with regard to 1 mg of nanoparticles and the right axis shows the cumulative release of BDNF referred to 1 mL release medium.</p

Representative microscopic images of spiral ganglion cell cultures cultivated for 48 h.

<p>The cells were cultivated in the presence of amino-modified nanoparticles (w/o BDNF), BDNF-loaded amino-modified nanoparticles (immobilized BDNF) and amino-modified nanoparticles with an exogenous addition of 50 ng mL^-1 BDNF (exogenous BDNF) in two different concentrations. For comparison, SGCs were also cultivated in serum-free SGC medium (medium) and in serum-free medium supplemented with BDNF (50 ng mL^-1 BDNF) as well as in a serum-free medium/PBS solution (1:1) (PBS (0.1% BSA)).</p

Zeta potential titration curves for the unmodified NPSNPs in comparison to the amino-modified NPSNPs.

<p>Zeta potential titration curves for the unmodified NPSNPs in comparison to the amino-modified NPSNPs.</p