Биологические методы стимуляции регенерации костей

Laboratorul Inginerie Tisulară şi Culturi Celulare, Catedra Chirurgie Operatorie şi Anatomie Topografică, Catedra Ortopedie, Traumatologie şi Chirurgie în Campanie, USMF “Nicolae Testemiţanu”Biological methods of bone regeneration are necessary to reverse bone loss resulting from various causes. Regenerative therapies could possibly utilize traditional autogenous and allogenous bone grafting or composite grafts, resorbable 3D scaffolds and differentiated or undifferentiated cells. Cell grafts are taken from autogenous bone marrow cells or alogenous cord blood stem cells. Gene expression systems may be combined with cells seeded in precise three-dimensional configurations on synthetic scaffolds to control both temporal and spatial distribution of regenerative factors. The natural processes of bone formation and repair require the coordinated expression of many molecules, growth factors, bone morphogenetic proteins, and specific transcription factors. Current knowledge of bone and fracture repair can explain tissue engineering and may mimic critical aspects of these natural processes. Approaches using gene therapy for bone regeneration are other means to promote good bone healing. These varied methods will eventually allow us to achieve a reconstruction of bone defects and stimulate bone healing.Биологические методы, использованные с целью костной регенерации, необходимы для восполнения потери костной ткани, вызванной различными факторами. В регенеративной терапии можно использовать традиционные аутологичные, аллогенные или комбинированные трансплантаты, включающие биодеградирующие 3Д губки и дифференцированные или малодифференцированные клетки. В качестве клеточного трансплантата могут быть использованы аутогенные костномозговые клетки или аллогенные – из пуповинной крови. Генно экспрессивные системы также могут быть комбинированы с тридименсиональными синтетическими структурами и с клетками для контроля временного и пространственного распределения регенеративных факторов. Натуральные процессы образования и восстановления кости требуют координированной экспрессии множества молекул, включающих факторы роста, морфогенетические белки и специфические транскрипционные факторы. Сегодняшние знания о регенерации кости позволяют стимулировать восстановительные процессы с помощью тканевой инжинерии. Генная инжинерия является новым направлением при попытке получения хорошего костного сращения. Такой подход, возможно, позволит добиться рекострукции костных дефектов и стимулировать костное сращение в случаях ее нарушения

Particularitățile proceselor regenerative în reconstrucția defectelor diafragmatice cu alogrefe decelularizate de pericard porcin în model experimental

Actualmente se depun eforturi considerabile în elaborarea unor materiale biologice decelularizate ca alternativă de corecție chirurgicală a defectelor diafragmatice. Scopul acestui studiu a fost evaluarea eficienței, siguranței și particularităților proceselor de regenerare și remodelare tisulară ale alogrefelor decelularizate de pericard porcin crioprezervate, utilizate în reconstrucția defectelor diafragmatice, create chirurgical în model experimental la porci. Lotul de studiu a inclus 6 purcei cu greutatea de 10 kg, supuși laparotomiei subcostale stângi cu reconstrucția defectului diafragmatic, creat chirurgical, cu grefe decelularizate de pericard porcin (lotul 1 - 3 animale) și peritoneu porcin (lotul 2 - 3 animale). Exameul radilogic efectuat în loul 1 la 15 zile postoperator a stabilit o configurație normală a neohemidiafragmului creat, la a 60 zi postoperator fiind documentată eventrația nesemnificativă a neohemidiafragmului. În lotul 2 la a 15 zi postoperator a fost observată o eventrație neînsemnată a neohemidiafragmului, ulterior, ambele animale acestui lot decedînd subit la a 54 și a 60 zi postoperator din cauza dehiscenței grefei. În lotul I au fost observate zone cu o fibrilogeneză atipică (malformativă) care se evidențiau printr-un aspect multichistic sau lacunarcavitar, cu suprafețe interne tapetate cu epiteliu mezotelial peritoneal unistratificat aplatizat fără aspecte de activitate mitotică. Formațiunea cavitar-chistică putea fi și o pseudotumoră chistică cu septuri mai subțiri, cu o carcasă redusă din fibre de colagen. La animalele lotului 2 în ambele cazuri s-a constatat un hemidiafragm cu defect persistent determinat de reabsorbția parțială a materialului biologic, necătînd că putea fi observat și zone de țesut neoformat. Așadar, grefele decelularizate de peritoneu porcin utilizate în reconstrucția chirurgicală a diafragmului sunt caracterizate de o biorezistență redusă, care poate contribui la reabsorbția parțială a acestui material biologic cu dezvoltarea unor complicații grave. Grefele decelularizate de pericard au o biorezistență acceptabilă comparativ cu cele de peritoneu porcin, aceste date sugend necesitatea unor studii suplimentare pe termen lung, care ar avea ca scop obținerea unor rezultate mai durabile.Considerable efforts are currently underway in the development of decellularized biologic materials as an alternative to surgical correction of diaphragmatic defects. The aim of this study was to evaluate the efficiency, safety and particularities of tissue regeneration and remodeling processes of allograft decellularized cryopreserved porcine pericardium, used in the reconstruction of diaphragmatic defects, surgically created in experimental model in pigs. The study group included 6 pigs weighing 10 kg, subjected to left subcostal laparotomy with surgical reconstruction of diaphragmatic defect, with decellularized grafts of porcine pericardium (1-3 animals) and porcine peritoneum (group 2- 3 animals). The radilogic examination performed in group 1 at 15 days postoperatively a normal configuration of the neohemidiaphragm created, at 60 postoperative day being documented the insignificant eventration of neohemidiaphragm. In group 2 to 15 postoperatively, a slight incidence of neohemidiaphragm was observed, after which both animals of this group died suddenly at 54 and 60 days postoperatively due to graft dehiscence. In 2 cases areas with atypical (malformative) fibrillogenesis were observed, which were evidenced by a multicystic or lacunar-cavity aspect, with internal surfaces covered with unistratified peritoneal mesothelial epithelium flattened without aspects of mitotic activity. The mesothelial cavity-cystic aspect has also been shown on border, in some cavities being present fibro-epithelial conjunctival micro-polyps. The cavity-cyst formation could also be a cystic pseudotumor with thinner septa, with a reduced collagen fiber housing. In the animals of lot 2, in both cases, there was a hemidiaphragm with persistent defect determined by the partial reabsorption of the biological material, although neoformed tissue areas could be observed. Therefore, decellularized porcine peritoneum grafts used in surgical reconstruction of the diaphragm are characterized by a low bioresistence which can contribute to the partial reabsorption of this biological material with the development of serious complications. Decellularized grafts of porcine pericardium have an acceptable bioresistence compared to porcine peritoneum, and this data suggests the need for further long-term studies that would seek to achieve more sustainable outcomes

Aспекты методики выделения коллагена

Laboratory of Tissue Engineering and Cells Cultures and Laboratory of Biochemistry, Nicolae Testemitanu State Medical and Pharmaceutical University, ChisinauBecause of the extreme diversity of tissues and types of collagen’ it is difficult to develop a standard method of extraction for all types of collagen from different tissues. Two procedures based on acid- and enzymatic-soluble collagen isolation were combined and offer some advantages and disadvantages to methods used in the present. Our results have demonstrated relatively low concentrations of collagen in the final solutions. There is 4.7 mg/ml from theoretically 10 mg/ml of acid-soluble fraction of collagen. This article describes some advantages and disadvantages of this isolation method. Due to the importance of biocompatible matrices for biomedical tissue engineering, the availability of native collagen should be studied by refining the extraction procedure of collagens. По причине чрезвычайного разнообразия тканей и типов коллагена содержащиеся в них, сложно разработать унифицированный метод получения коллагена. Были объединены две процедуры выделения коллагена, основанных на кислотном и ферментном растворении коллагена животного происхождения. Наши результаты показали относительно невысокие концентрации коллагена в конечном растворе, что составляет 4,7 мг/мл кислото-растворимого коллагена из теоретически возможных 10 мг/мл. В статье описаны некоторые преимущества и недостатки существующих методов. Разработка методов выделения коллагена первого типа важна по причине его использования для получения биосовместимых матриц и их применения в тканеинженерных конструкциях

Действие низкого частотного импульсного электромагнитного поля на пролиферацию и морфологию мезенхимальных стволовых клеток

Universitatea de Medicină şi Farmacie «Nicolae Testemiţanu», Laboratorul “Iniginerie tisulară şi culturi celulare”, Laboratorul Institutulului de Fizică al AŞM, Conferinţa Știinţifică Internaţională ”Probleme actuale ale morfologiei” dedicată сentenarului profesorului B.Z. Perlin, Chişinău, 20-22 septembrie 2012Stimulation of cell divisionis the source of physiological recovery that provides the most reliable perspective in tissue engineering. A non-invasive and accessible method of amplifying the process of cell division is using electromagnetic fields. Our purpose was to analyze the oscillating electromagnetic fields capacity to influence the cellular proliferation in vitro. For this purpose, were used cell cultures of mesenchymal stem cells, derived from 14 days aviary embryos. Cells were subjected toaquasi-rectangular pulse del ectromagnetic field with duration of 300μs, a frequency of 7.5Hz, 2hours each day for 7days. The results indicate arise with 25% of the number of cells subjected to the magnetic field, and this report was not influenced by the cell density. The cell morphology showed no difference between groups. These results suggest the possibility of using low frequency pulsed electromagnetic fields in tissue engineering with the purposes to accelerate mesenchymal stem cell division, which can be applied in bone regeneration therapy. Стимуляция физиологическго деления клеток является источником восстановления клеток, который обеспечивает наиболее надежные перспективы в тканевой инженерии. Использование электромагнитных полей является неинвазивным и доступным методом усиления процесса деления клеток. Целью этой работы был анализ способности пульсных электромагнитных полей влиять на клеточную пролиферацию in vitro. Для этой цели использовали культуру мезенхимальных стволовых клеток, полученных из птичьих эмбрионов. Клетки подвергались квази-прямоугольных пульсных электромагнитных полей с длительностью 300 μs, частота 7,5 Гц, 2 часа каждый день в течение 7 дней. Полученные результаты указывают на 25% рост количества клеток в группе подвергнутом магнитному полю чем в контрольной, и результат не зависит от плотности клеток. Морфология клеток не выявило различий между группами. Эти результаты свидетельствуют о возможности использования низкочастотных пульсных электромагнитных полей в тканевой инженерии с целью ускорить деление мезенхимальных стволовых клеток

Characteristics of histomorphopathological changes in regional tissues in gastroschisis in newborns

Laboratorul de infecții chirurgicale la copii, Catedra chirurgie operatorie și anatomie topografică, USMF ,,Nicolae Testemițanu”, Chișinău, Republica Moldova,Conferința stiințifică „Nicolae Anestiadi – nume etern al chirurgiei basarabene” consacrată centenarului de la nașterea profesorului Nicolae Anestiadi 26 august 2016Introducere. Prioritar în gastroschisis îl reprezintă reducerea primară a defectului și închiderea lui unimomentană. Această strategie chirurgicală se asociază cu diverse complicații grave care determină evoluția nefavorabilă a bolii. Scopul studiului. Consta în evaluarea gravității modificărilor morfopatologice ale țesuturilor din regiunea defectului congenital al peretelui abdominal la nou-născuții cu gastroschizis. Rezultate. Investigațiilor histomorfopatologice, completate cu cele obținute prin metoda imunohistochimică aplicată în 20 de cazuri, au permis identificarea unei game largi de modificări structurale vicioase, de origine displazică şi inflamatoare, dezvoltate la diverse termene de gestație. Microanatomic, la marginea zonei defectului musculofascial al peretelui abdominal, localizat în toate cazurile analizate în dreapta cordonului ombilical, a fost atestată prezenţa unui inel de pliu conjunctiv lax şi/sau fibros, dotat cu o reţea arterio-venoasă, alcătuită din capilare şi vase de calibru mic. Spre abdomenul regional, pe traiectul reţelei vasculare, în aria ţesutului muscular abdominal se dispersează fâşii sau platouri conjunctive care trec lent în fasciile intramusculare sau direct în tecile conjunctive musculare, unele cu aspect cicatricial. Astfel, la acest nivel se formează puncte de trecere dintre două tipuri de structuri tisulare, cu prezenţa componentelor vasculo-musculare şi a fasciculelor tronculare nervoase. Concluzie. Modificările regionale în gastroschisis la nou-născuți sunt dominate de neconcordanţa marcantă în maturizarea elementelor musculofasciale și ganglioneuronale, indiferent de termenul de gestaţie, asociată cu aranjamentul dezordonat al miocitelor şi al fasciculelor musculare, cu dereglări ale intensității de expresie imunohistochimică a structurilor neuronale, fapt ce denotă prezenţa unor dereglări funcţionale neuromusculare atât în preajma defectului, cât şi la distanţă.Introduction. To reduce the primary defect in gastroschisis and to close it immediately. This surgical strategy is associated with various severe complications which cause an unfavorable evolution of the disease. Purpose. To assess the severity of morphopathological changes in the tissues of the congenital abdominal wall defect region in neonates with gastroschisis. Results. The results of histomorphopathological investigation and those of immunohistochemical method applied in 20 cases allowed to identify a wide range of vicious dysplastic and inflammatory structural changes, developed at different gestational periods. Microanatomically, on the edge of the musculofascial defect of the abdominal wall, located in all cases analyzed in the right side of the umbilical cord, there was attested the presence of a ring of connective lax and/or fibrous fold, supplied with an arterio-venous network, made up of capillaries and small blood vessels. Toward the regional abdomen, on the vasculature path in the area of theabdominal muscle tissue, connective strips or plates are slowly dispersed passing into intramuscular fascia or directly into the connective muscle sheaths, some of them looking as scars. Thus, at this level some crossings between the two types of tissue structures are formed, with the presence of vascular-muscular components and truncal nerve bundles. Conclusion. Regional changes in gastroschisis in newborns are dominated by marked inconsistency in the maturation of musculofascial and ganglioneuronal elements, regardless of the gestational age associated with the disordered arrangement of myocytes and muscular fascicles ,with disorders of the intensity of immunohistochemical expression of neural structures. This fact denotes the presence of some functional neuromuscular disorders both around the defect and away from it

Cell scaffold for tissue engineering

Laboratorul de inginerie tisulară și culturi celulare, USMF „Nicolae Testemițanu”, Chișinău, Republica Moldova, Conferința stiințifică „Nicolae Anestiadi – nume etern al chirurgiei basarabene” consacrată centenarului de la nașterea profesorului Nicolae Anestiadi 26 august 2016Scop. Obținerea unui suport tridimensional hibrid din colagen tip I și chitosan pentru fixarea celulelor cultivate in vitro, favorizarea adeziunii celulare și proliferării acestora. Material și metode. Materiale utilizate pentru obținerea spongiei hibride colagen/chitosan au fost tendoane de bovină care după mărunțire au fost prelucrate cu soluție de 0,05M de Na2HPO4 timp de 4 zile, după care s-a supus procesului de digestie enzimatică cu pepsină în cantitate de 100 mg/gram tendon cu acid acetic EDTA timp de 24 de ore la 4°C. Apoi colagenul obținut se purifică prin precipitarea cu 1,8M NaCl, după care se dizolvă cu acid acetic și se dializează în săculețe cu dimensiunile porilor de 12000 Da (Sigma) într-un volum mare de soluție de 0,02M Na2HPO4 pînă pH-ul soluției de colagen devine neutru sau slab bazic, apoi acesta se îngheață la -60°C și se lasă la dezghețat la temperatura camerei. Colagenul se separă de restul lichidului prin centrifugare la 1000 g timp de 10 min. Colagenul obținut se dizolvă cu acid acetic pînă la concentrația de 1%, apoi se liofilizează (EVD-12; Unicryo MCL-60). Spongia obținută se tratează timp de 24 de ore cu soluție chitosan de 0,25%. Apoi se spală cu apă distilată pe vibrator (Leleux, Laborwelt, V7032) cu schimbarea apei. După care spongia cu chitosan se usucă prin liofilizare și ulterior reticulează la temperatura camerei în aburi de glutaraldehidă de 12,5% (SERVA) timp de 24 ore. Rezultate. Dimensiunile porilor în cazul spongiei colagenice variază între 50 și 200μ, iar în cazul spongiilor hibride dimensiunile porilor variază între 30 și 100μ. Concluzii. Tehnică de obținere a matricei hibride din colagen este una efectivă. Structura microscopică și dimensiunile spongiei permit de a fi utilizată pentru suplinirea unor defecte de țesuturi, cît și utilizarea pentru ingineria tisulară.Purpose. To obtain a three-dimensional collagen type I/chitosan scaffold for seeding the cells cultured in vitro, and promotion of cell adhesion and proliferation. Materials and methods. Materials used to obtain a collagen I/chitosan hybrid scaffold were bovine tendons that after mincing have been processed with 0,05M Na2HPO4 solution for 4 days, followed by enzymatic digestion with pepsin 100 mg per 1gr. of tendon, EDTA and acetic acid for 24 hours at 4°C. Then collagen was purified by precipitation with 1.8 M NaCl, followed by acetic acid dissolution and dialysis in bags with 12000 Da pore size by a large volume of 0.02 M Na2HPO4 solution, until pH of collagen solution become neutral or weak base, then it was frozen at -60 °C and allowed to thaw at room temperature. Collagen is separated from the remaining liquid by centrifugation at 1000 g for 10 min. The obtained collagen is dissolved with acetic acid to a concentration of 1%, then freeze-dried (EVD-12; Unicryo MCL-60). Obtained sponge was treated with 0.25% chitosan solution for 24 hours, then washed with distilled water on a vibrator, frequently changing the water. After that the collagen/chitosan sponge is freeze-dried and cross-linked at room temperature in a vapor chamber with 12.5% glutaraldehyde (SERVA) for 24 hours. Results. Pore size in native collagen sponge varies between 50 and 200μ, but in the case of hybrid collagen/chitosan sponge, pore size varies between 30 and 100μ. Conclusion. The obtaining method of a hybrid collagen/chitosan scaffold for cell seeding is effective. The sponge size and microscopic structure allow its utilisation in filling tissue defects and tissue engineering

Cтволовые клетки в стоматологии будущего

Tooth loss compromises human oral health. Although several prosthetic methods (such as artificial denture and dental implants) are clinical therapies to tooth loss problems, they are thought to have safety and usage-time issues. Recently, tooth tissue engineering has attracted more and more attention. Stem cell based tissue engineering is thought to be a promising way to replace the missing tooth. Mesenchymal stem cells (MSC) are multipotent stem cells which can differentiate into a variety of cell types. The potential MSC for tooth regeneration mainly include stem cells from human exfoliated deciduous teeth, adult dental pulp stem cells, stem cells from the apical part of the papilla, stem cells from the dental follicle, periodontal ligament stem cells and bone marrow-derived mesenchymal stem cells. This review outlines the recent progress in mesenchymal stem cell research and its use in tooth regeneration and oral and craniofacial applications.Потеря зубов ставит под угрозу человеческое здоровье. Ткани зуба у взрослых практически не способны к самостоятельной регенерации и дефект эмали, возникающий в результате действия повреждающих факторов, постепенно приводит к потере зуба. Без сомнения, современные технологии протезирования позволяют произвести реконструкцию даже при полном отсутствии зубов. Однако прогресс современной органотипической регенеративной медицины заставляет исследователей искать новые технологии замещения зубов естественными трансплантатами. Последнее время клеточная инженерия тканей зуба привлекает все больше и больше внимания. Стволовые клетки являются многообещающим способом замены недостающего зуба. Мезенхимальные стволовые клетки способны дифференцироваться в клетки костной ткани, что дает возможность использовать их для восстановления зуба. Этот обзор рассматривает современные исследования стволовых клеток и возможность их использования для стимуляции репаративной регенерации тканей зуба

Morphopathological aspects in uncomplicated omphalocele in infants

Laboratorul de infecții chirurgicale la copii, Catedra chirurgie operatorie și anatomie topografică, USMF ,,Nicolae Testemițanu”, Chișinău, Republica Moldova, Conferința stiințifică „Nicolae Anestiadi – nume etern al chirurgiei basarabene” consacrată centenarului de la nașterea profesorului Nicolae Anestiadi 26 august 2016Introducere. În pofida faptului că strategiile de corecţie chirurgicală a defectelor congenitale ale peretelui abdominal au evoluat considerabil, prognosticul acestor malformaţii rămâne sever. Scopul. Estimarea proceselor reparatorii în omfalocelul necomplicat de diferite dimensiuni la nou-născuți. Materiale și metode. Lotul de studiu a inclus 18 nou-născuți cu omfalocel: vârsta gestaţională 37-40 săptămâni, masa ponderală 2850-3780 g, scorul Apgar 7-8, diametrul omfalocelului între 3,5 cm şi 7,5 cm. Rezultate. În peretele omfalocelului, în regiunea limitrofă cu structurile tisulare abdominale, la 1,5-3 cm de la bolta omfalocelului, au fost depistate structuri mozaice asemănătoare arhitectural cu cele ale peretelui abdominal. Indiferent de volumul omfalocelului, microarhitectural, pe toată suprafaţa internă a acestuia era prezent mezoteliul, care forma, spre periferie, un strat de ţesut conjunctiv lax bogat vascularizat, urmat de un strat comparativ mai dens fascicular fibromuscular, cu predilecţie de origine conjunctivă fibrilară sau fasciculară. Spre periferie, componenta gelatinoasă putea fi circumscrisă, în divers raport, de elemente celulare fibrocitar-fibroblastice, printre care puteau fi întâlnite capilare mici şi angioblaste. La exterior a fost depistat un strat epitelial pavimentos scuamos, care spre apexul omfalocelului involua într-un strat pluristratificat sau unistratificat de amniocite, în unele cazuri fiind observate degenerescenţe alterative şi hidropice. Concluzii. Așadar, în cazurile de omfalocel necomplicat de dimensiuni majore, cu disproporție visceroabdominală semnificativă, este justificată conduita conservativă întrucât, ținând cont de structura arhitecturală a sacului, există condiții favorabile pentru procesele reparative cu epitelizarea treptată a sacului și transformarea lui în hernie ventrală, ceea ce a favorizat rata scăzută a letalității în lotul studiat.Despite the fact that strategies of surgical correction of the congenital abdominal wall defects have evolved considerably, the prognosis of these malformations is severe. The purpose of the study was to estimate restorative processes in various sized uncomplicated omphalocele in newborns.The study group included 18 newborns with omphalocele: gestational age -37-40 weeks, weight -2850-3780 g, Apgar score 7-8, omphalocele diameter between 3.5 cm and 7.5 cm. There were discovered some mosaic structures in the omphalocele wall, in the surrounding region of the abdominal tissue structures, 1.5-3 cm from the omphalocele vault. Architecturally, they were similar to those of the abdominal wall. Irrespective of the omphalocele volume, microarchitecturally, the mesothelium was present on its entire inner surface, forming a layer of richly vascularized and lax connective tissue towards the periphery, followed by a comparatively denser fascicular fibromuscular layer, predominantly being connective fibrillar or fascicular. The gelatinous component could be circumscribed, in various ratio, towards the periphery, by fibrocyte-fibroblast cellular elements, among which small capillaries and angioblasts could be seen. On the outside a pavement-like squamous epithelial layer was found, which, towards the omphalocele apex, devolved into a multistratified or unistratified layer of amniocytes. In some cases alterative and hydropic degeneration was observed. Thus, in cases of oversized uncomplicated omphalocele with significant visceroabdominal disproportion, the conservative approach is justified, whereas, considering the architectural structure of the sack, there are favorable conditions for reparative processes with gradual epithelialization of the sack and its transformation into a ventral hernia, which favored a low rate of lethality in the studied group

Autologous chondrocyte culture for cell therapy

Laboratorul de inginerie tisulară și culturi celulare, USMF „Nicolae Testemițanu”, Chișinău, Republica Moldova, Conferința stiințifică „Nicolae Anestiadi – nume etern al chirurgiei basarabene” consacrată centenarului de la nașterea profesorului Nicolae Anestiadi 26 august 2016Scop. Izolarea condrocitelor din cartilaj hialin și expansionarea acestora în culturi celulare pentru transplantarea ulterioară în defectul de cartilaj. Material și metode. Studiul s-a efectuat pe 9 iepuri de rasa neozeelandeză de 6 luni. În condiții sterile s-a prelevat cartilajul hialin de la nivelul regiunii neportante a articulației genunchiului, după care s-a tratat cu tripsină-EDTA de 0,25% timp de 30 min, apoi cu colagenază de 0,6% timp de 6 ore. Celulele au fost cultivate în flacoane de cultură celulară a cîte 10000 ±500 cel/cm2 în mediu de nutriție DMEM cu 10% FBS în incubator cu 5% CO2 la temperatura de 37°C. Celulele s-au expansionat în culturi până la o confluență de 80%, timp de 21 de zile. Numărarea celulelor s-a efectuat cu hemocitometru. Condrocitele s-au colorat cu Safranin O și albastru de tuloidină/fast green. Rezultate. Din aproximativ 50 ±10 mg de cartilaj prelevat s-au izolat 4x105±5x104 celule. La colorarea condrocitelor cu Safranin O, nucleii celulelor erau de culoare întunecată, citoplasma sur-verzuie, iar mucina și cartilajul oranj spre roșu. La colorarea cu albastru de tuloidină/fast green nucleii au apărut de culoare albastru închis, cartilajul albastru-violet intens iar fundalul verde. Concluzii. Metoda de izolare a condrocitelor din cartilaj hialin este una eficientă și a fost confirmată prin intermediul colorării celulelor in vitro cu Safranin O și albastru de tuloidină/fast green. În continuare este necesară implantarea in vitro a condrocitelor pe suport tridimensional și transplantarea lor în defectul osteocondral.Purpose. Isolation of chondrocytes from articular hyaline cartilage and their expansion in cell cultures for further transplantation in a cartilage defect. Materials and methods. The study was performed on 9 New Zealand White rabbit 6 months old. Under sterile conditions, slices of hyaline cartilage were harvested from unbearing area of knee joint, followed by 0,25% tripsină-EDTA treatment for 30 min and 0,6% collagenase for 6 hours. The cells were cultivated in cell culture flasks by 10000 ±500 cell/cm2 and incubated at 37 ° C with 5% CO2 in DMEM with 10% FBS. The cells were expanded in culture up to 21 days to a confluence of 80%. The cells were counted by a hemocytometer. The chondrocytes were stained with Safranin O and toluidine blue/fast green. Results. From approximately 50±10 mg of cartilage were isolated 4x105±5x104 cells. At staining chondrocytes with Safranin O, the nuclei were black, the cytoplasm gray-green and and cartilage, mucin were orange to red. At staining chondrocytes with toluidine blue/fast green, the nuclei appeared dark blue, the cartilage blue, deep purple and background green. Conclusion. The method of chondrocytes isolation from hyaline cartilage is efficient and it was confirmed by in vitro cell staining with Safranin O and toluidine blue/fast green. Our further purpose is implantation in vitro of expanded chondrocytes on tridimensional scaffold and their transplantation in an osteochondral defect

Bone marrow nucleated autocells in treatment of femoral head osteonecrosis in adults (preliminary report)

Clinica ortopedie și traumatologie „Vitalie Bețișor”, Laboratorul de inginerie tisulară și culturi celulare, USMF „Nicolae Testemițanu”, Chișinău, Republica Moldova, Conferința stiințifică „Nicolae Anestiadi – nume etern al chirurgiei basarabene” consacrată centenarului de la nașterea profesorului Nicolae Anestiadi 26 august 2016Scopul. Elaborarea unui protocolul de colectare, procesare, multiplicare și administrare a autocelulelor nucleate din măduva osoasă pentru tratamentul osteonecrozei de cap femural la adult. Material şi metode. Studiul a fost realizat în cadrul Laboratorului de inginerie tisulară şi culturi celulare și Clinica Ortopedie şi Traumatologie ’’V. Bețișor” al USMF ’’N. Testemiţanu”. Inițial au fost efectuate studii preclinice pe animale de laborator la care s-au obținut rezultate favorabile. A fost elaborat protocolul recoltării (aspirat de măduvă osoasă în volum de 40 ml din crista iliaca postero-superioară), separării și multiplicării pe mediu nutritiv (DMEM cu 10% autoser) în incubator CO2 până la 12,6±1,5x106 celule/ml. După 5-6 zile, suspensia celulară, a fost inoculată cu ajutorul unei trefine speciale sub control Rx în focarul necrotic. În prima jumătate a anului 2015 au fost tratați prin această metodă 8 pacienți adulți cu diagnosticul de osteonecroză de cap femural (6 în stadiul II și unul în stadiul IIIa). A fost elaborată o conduită postoperatorie care a constat din: repaus funcțional cu sprijin dozat pe membrul afectat timp de o lună, oxibaroterapie, preparate pentru ameliorarea microcirculației, preparatele vit. B, bisfosfonați.Rezultate. La toți pacienții postoperator s-a determinat un grad înalt de satisfacție datorită dispariției durerilor. La investigația imagistică progresie în focarul necrotic nu s-a depistat în nici un caz. Concluzii. Luând în considerație evoluția clinică favorabilă și datele literaturii considerăm necesare prelungirea studiilor în acest domeniu.Purpose. Protocol elaboration for prelevation, processing, multiplication and administration of bone marrow nucleated autocells in treatment of avascular femoral head osteonecrosis in adults. Materials and methods. The study was performed in the Laboratory ’’Tissue engineering and cell cultures’’ and Orthopaedics and Traumatology clinic ’’Vitalie Bețișor”. Pre-clinical studies with favorable results were obtained on laboratory animals. A procedure protocol was elaborated for collecting bone marrow (aspiration of 40 ml bone marrow from posterior superior iliac crest), cells separation and multiplication on nutrient medium (DMEM with 10% autoserum) in CO2 incubator until reach to 12,6±1,5x106 cells/ml. After 5-6 days, the cell suspension was inoculated in necrotic area using a special cannulated needle Rx guided. In first half of 2015, using this method, were treated 8 adult patients diagnosed with osteonecrosis of the femoral head (6 in stage II and 1 in stage IIIa). All patients followed a special postoperative care that consists in: functional rest with dosed support on affected limb for one month, oxibarotherapy, medicamentous microcirculation enhancement, group B vitamins and bisphosphonates. Results. All patients after surgery declared a high degree of satisfaction due to pain disappearance. On imaging investigation progression of necrotic area was not determined in all cases. Conclusions. Due to a favorable clinical evolution and conducive literature data, we consider mandatory continuation of studies