Межфазный катализ липолитических реакций в биоорганической химии: особенности и практическое применение

The main experimental results on interfacial catalysis of lipolytic reactions involving phospholipases A2 and C with different specificity in the presence of some biologically active compounds containing fragments that could potentially interact with functionally important sites of the active center of these lipolytic enzymes, have been discussed. It has been suggested to use phospholipolysis as an indicator to determine the biosafety of xenobiotics and diagnostics of acute ne-crotizing pancreatitis.Обзор основных экспериментальных результатов в области изучения межфазного катализа липолитических реакций с участием фосфолипаз А2 и С разной специфичности в присутствии ряда биологически активных соединений, содержащих в своей структуре фрагменты, которые потенциально могут взаимодействовать с функционально значимыми участками активного центра этих липолитических ферментов. Предложено использование фосфолипо-лиза в качестве индикатора для определения биобезопасности ксенобиотиков и диагностики острого некротического панкреатита

Многоцелевые биореакторы на основе фосфолиполиза

Overview of the main experimental results in the field of new directions of phospholipolysis practical applications - enzyme therapy and diagnostics are presented. Phospholipases, which are enzymes that hydrolyze phospholipids, are known as markers of socially dangerous diseases: oncological, cardiovascular, infectious, inflammatory, etc. We proposed a number of diagnostic biosystems based on phosphatideacylhydrolases and hemoproteins: Phospholipase A2-ligand, Phospholipase A2-cytochrome P450, Phospholipase A2-myoglobin, Phospholipase A2-hemoglobin. The latter system was used to produce and implement for the first time in the clinical practice the diagnostic kit PLA2-PHOA for identifying patients with necrotic pancreatitis. The results of preclinical and clinical testing of the PLA2-PHOA kit for the detection of pancreatitis based on the determination of the activity of phospholipase A2 of blood are presented and discussed.Представлен обзор основных экспериментальных результатов в области новых направлений (энзимо-терапия и энзимодиагностика) практического использования ферментативного гидролиза фосфолипидов (фосфолиполиза), нарушение которого приводит к развитию ряда социально опасных заболеваний: онкологических, сердечнососудистых, инфекционных, воспалительных и т. д. Разработан ряд многоцелевых биореакторов на основе использования ферментов фосфолипаз А2 (ФЛА2), принимающих участие в фосфолиполизе: одноферментные нанореакторы ФЛА2-лиганд и сопряженные биферментные нанореакторы; ФЛА2-гемоглобин; ФЛА2-миоглобин; ФЛА2-цитохром Р-450 (CYP2B4) и ФЛА2- цитохром Р-450 (CYP3A4)

Роль пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов и их производных в реакциях, катализируемых панкреатической фосфолипазой А2

A review of the results of studying the relationship in the system “nucleosides–phospholipase A2”, which plays a decisive role in the metabolism of phospholipids and their derivatives – prostaglandins, thromboxanes and leukotrienes as the most important intracellular messengers, is presented. The review considers the effect of nucleosides on the activity of secretory PLA2 and the metabolism of liponucleosides, which are of interest as specific delivery vehicles for nucleoside drugs. The results of these studies are considered from the point of view of the pharmacological potential of liponucleosides as new forms of known drugs.Представлен обзор результатов изучения взаимосвязи в системе «нуклеозиды–фосфолипаза А2», которая играет определяющую роль в метаболизме фосфолипидов и их производных – простагландинов, тромбоксанов и лейкотриенов как важнейших внутриклеточных мессенджеров. Рассмотрено влияние нуклеозидов на активность секреторной ФЛА2 и метаболизм липонуклеозидов, представляющих интерес в качестве специфических средств доставки нуклеозидных лекарств. Результаты этих исследований рассмотрены с точки зрения фармакологического потенциала липонуклеозидов как новых форм известных лекарственных препаратов

ПРИКЛАДНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ ФОСФАТИДАЦИЛГИДРОЛАЗ В ИЗУЧЕНИИ ВЗАИМОСВЯЗИ «СТРУКТУРА – ФУНКЦИЯ» В РЯДУ БИОПОЛИМЕРОВ И НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ БИОРЕГУЛЯТОРОВ

Overview of the main experimental results in the field of applied enzymology of phosphatidacylhydrolases in a study of the structure – function relationship in the process of a phospholipolysis including soluble (hemoglobin), peripheral (b5), integral (CYP2B4) and anchor (CYP3A4) proteins, as well as low-molecular bioregulators (chlorine- and phosphoorganic compounds, derivatives of 1,3-cyclohexanedione, oxazole, the tiotetronic and fatty acids). The strategic prospects of development of scientific research and innovation within bioorganic chemistry at the field of applied (engineering) enzymology involving phospholipolytic enzymes, are discussed. Представлен обзор основных экспериментальных результатов в области прикладной энзимологии фосфатидацилгидролаз при исследовании взаимосвязи «структура – функция» в процессе фосфолиполиза с участием растворимых (гемоглобин), периферических (цитохром b5), интегральных (CYP2В4) и якорных (CYP3А4) белков, а также низкомолекулярных биорегуляторов (хлор- и фосфорорганические соединения, производные 1,3-циклогек- сандиона, оксазола, тиотетроновых и жирных кислот). Обсуждены стратегические перспективы развития научных исследований и инновационных технологий в рамках биоорганической химии по направлению прикладная (инженерная) энзимология с участием фосфолиполитических ферментов.

Сопряжение фосфолиполиза и монооксигеназного катализа

A review of the main experimental results in the field of studying the interaction in vivo and in vitro of enzyme systems responsible for the metabolism of arachidonic acid is presented. Metabolic events from its release from phospholipids (phospholipase A2) to its transformation (cytochromes P450) into the most important intracellular messengers of external signal transmission to the internal “language of the cell” are discussed.Представлен обзор основных экспериментальных результатов в области исследования взаимодействия in vivo и in vitro ферментных систем, ответственных за метаболизм арахидоновой кислоты. Обсуждаются возможные взаимосвязи на пути ее высвобождения из фосфолипидов (фосфолипазы А2) до превращения (цитохромы Р450) в важнейшие внутриклеточные мессенджеры передачи внешнего сигнала на внутренний «язык клетки»

Гидролиз УФ-индуцированного перекисно-окисленного фосфатидилхолина фосфолипазами разной субстратной специфичности

The activity of porcine pancreatic phospholipase A2 and the same of cobra venom toward phosphatidylcholine having different supramolecular organization and interfacial charge (micelles with sodium deoxycholate and liposomes) under UV irradiation (180–400 nm) was studied. It was shown that the UV-irradiated lipid phase is characterized by an increased index of phosphatidylcholine oxidation and the absence of a peak with a maximum of 235.5 nm, related to the presence of unsaturated bonds in the UV spectrum of docosahexaenoic acid, but retained in the presence of the antioxidant trolox. The activation of both phospholipases A2 after UV irradiation of the substrate was established, regardless of its supramolecular organization, the charge of the interfacial surface, and the substrate specificity of the enzymes. Using dynamic light scattering, 0.3 % of larger particles were found among the irradiated micelles of phosphatidylcholine. The results obtained indicate that areas of accumulation of hydroperoxidized lipids can be formed in the irradiated model membrane, which serve as a site of intensified attack for phospholipases.Исследована активность фосфолипазы А2 из панкреатической железы свиньи и яда кобры по отношению к фосфатидилхолину, имеющему разную надмолекулярную организацию и заряд межфазной поверхности (мицеллы с дезоксихолатом натрия и липосомы) в условиях УФ-облучения (180–400 нм). Показано, что УФ-облученная липидная фаза характеризуется увеличенным индексом окисления фосфатидилхолина и отсутствием в УФспектре докозогексаеновой кислоты пика с максимумом 235,5 нм, отражающем наличие непредельных связей, который сохраняется в присутствии антиоксиданта тролокса. Установлена активация обеих фосфолипаз А2 после УФоблучения субстрата независимо от его супрамолекулярной организации, заряда межфазной поверхности и субстратной специфичности ферментов. С помощью динамического рассеяния света в облученных мицеллах фосфатидилхолина обнаружено 0,3 % частиц большего размера. Полученные результаты указывают на то, что в облученной модельной мембране могут формироваться участки скопления гидропероксидированных липидов, которые служат местом усиленной атаки для фосфолипаз

Ингибирование фосфолипазы А2 производными виразола

Kinetics of phosphatidylcholine (PC) hydrolysis under the action of pancreatic phospholipase A2 IB, (EC 3.1.1.4, PLA2) in the presence of a lipophilic derivative of the antiviral drug Virazole 1-(3-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)-4-hydroxy-5- (((4-methoxyphenyl)diphenylmethoxy)methyl)tetrahydrofuran-2-yl)-1H-1,2,4-triazole-3-carboxamide (Virazole2ЗГ) was studied. The both steps of phospholipolysis were quantitatively characterized: the binding of the enzyme to the lipid-water interface (Ks) and directly the catalytic act (Km) with the determination of the maximum reaction rate (Vmax). It was found that Virazole2ЗГ at a concentration of 0.5 μmol/ml does not affect the Ks value; on the contrary, the Michaelis constant, Km, increases by a factor of 1.8 along with the constancy of the parameter Vmax. Based on the constancy of the Ks values, it seems to be assumed that there is no inhibition of the disintegration of the enzyme-micelle complex in the presence of the effector under the studied reaction conditions. The kinetic parameters of the reaction (the increase in Km and the constancy of Vmax in the presence of Virazole2ЗГ) testify in favor of a moderate competitive inhibition of pancreatic PLA2, Ki = 65 mM, which indicates the possibility of searching for the biological activity of the anti-pancreatitis action in the series of pro-drugs of nucleoside nature.Изучена кинетика гидролиза фосфатидилхолина (ФХ) под действием панкреатической фосфолипазы А2 IB (КФ 3.1.1.4, ФЛА2) в присутствии липофильного производного виразола – 1-(3-(трет–бутилдиметилсиланилокси)-4-гидрокси-5-(((4-метоксифенил)дифенилметокси)метил) тетрагидрофуран-2-ил)-1H-1,2,4-триазол-3-карбоксамида (Виразол2ЗГ), обладающего противовирусным действием. Количественно охарактеризованы обе стадии фосфолиполиза: связывания фермента (Ks) с поверхностью раздела фаз «липид–вода» и непосредственно каталитический акт (Km) с определением максимальной скорости реакции (Vmax). Обнаружено, что Виразол2ЗГ в концентрации 0,5 мкмоль/мл не влияет на величину Ks; напротив, константа Михаэлиса, Km, возрастает в 1,8 раза наряду с постоянством параметра Vmax. На основании постоянства величин Ks можно предполагать отсутствие в условиях данного эксперимента торможения распада комплекса фермент–мицелла в присутствии эффектора. Кинетические параметры реакции (увеличение величины Km и неизменность Vmax в присутствии Виразол2ЗГ) свидетельствуют в пользу умеренного конкурентного ингибирования панкреатической ФЛА2, Ki = 65 мМ, что указывает на возможность поиска биологической активности антипанкреатитного действия в ряду про-лекарств (pro-drugs) нуклеозидной природы

Влияние N(фосфонометил)-глицина на фосфолиполитическую реакцию с участием фосфолипазы А2

The effect of N(phosphonomethyl)-glycine (glyphosate), the active ingredient of the «Squall» herbicide in a wide range of concentrations (1-1000 |ig/ml) on phospholipolysis catalyzed by pancreatic phospholipase A2 (PLA2, 3.1.1.4), under the conditions similar to digestion in the duodenum (pH 8.0, temperature S, micellar form PC), has been studied. It has been shown that a rapid method based on the use of in vitro phospholipolytic reaction as a simple model of the process of destruction of food and phospholipids of cell membranes, is promising for preliminary evaluation of the pesticide safety to humans and animals.Изучено влияние N(фосфонометил)-глицина (глифосата) - действующего вещества гербицида «Шквал» в широком диапазоне концентраций (1-1000 мкг/мл) на фосфолиполитическую реакцию, катализируемую панкреатической фосфолипазой А2 (ФЛА2, КФ 3.1.1.4), в условиях, близких к пищеварению в двенадцатиперстной кишке (рН 8,0, температура 37 °С, мицеллярная форма ФХ). Двумя независимыми методами, характеризующими накопление продуктов фосфолиполиза - лизофосфатилилхолина (с использованием ТСХ) и жирной кислоты (с регистрацией под ее действием спектральных изменений MetHb), установлено разнонаправленное действие глифосата на активность ФЛА2: в присутствии безопасных для человека и животных доз (до 100 мкг/мл) - активация в 1,4 раза, а под действием запредельных доз (до 1000 мкг/мл) - ингибирвание до 20% остаточной активности. Ингибиторная активность глифосата в концентрации 0,5 мМ при ферментативном гидролизе ФХ в мицеллярной фазе характеризуется величиной Кi равной 24 мМ, а ингибирование носит конкурентный характер. Показано, что экспресс-метод на основе использования in vitro фосфолиполитической реакции в качестве простой модели процесса разрушения фосфолипи-дов пищи и клеточных мембран перспективен в целях предварительной оценки безопасности пестицидов для человека и животных

ФОСФОЛИПАЗА А2 IB – НОВЫЙ ИНДИКАТОР ОЦЕНКИ ПРО-АНТИОКСИДАНТНОГО СТАТУСА ОРГАНИЗМА

The efficiency of free radical oxidation of phospholipid membranes under exposure to UV radiation (λ = 180– 400 nm) by the phospholipase A2 PLA2 IB as a marker of lipid peroxidation was studied. Mixed micelles of phosphatidylcholine and sodium deoxycholate were employed as the model of phospholipid membranes. The PLA2 activity was determined by spectral changes in hemoglobin upon the interaction with fatty acids, resulting from a phospholipolysis product. At the same time, the level of lipid peroxidation was estimated by accumulation of malondialdehyde as a well-known product of irradiation of phospholipids. The directly proportional dependence of the PLA2 activity on the UV irradiation time of phospholipids is obtained. It is shown that the level of the PLA2 activity correlates well with the lipid peroxidation level, pointing to the antioxidant capacity of blood in comparison with the well-known antioxidant Trolox as standard.  Изучена эффективность свободнорадикального окисления в фосфолипидных мембранах под воздействием УФ-облучения (λ = 180–400 нм) с помощью фосфолипазы А2 (ФЛA2 IB) как маркера перекисного окисления липидов. Смешанные мицеллы фосфатидилхолина и дезоксихолата натрия были использованы в качестве модели фосфолипидных мембран. Активность ФЛA2 определяли по спектральным изменениям гемоглобина при взаимодействии с жирными кислотами как продуктами фосфолиполиза. Уровень перекисного окисления липидов в то же время оценивали по накоплению малонового диальдегида как хорошо известного продукта облучения фосфолипидов. Получена прямо пропорциональная зависимость активности ФЛA2 от времени УФ-облучения фосфолипидов. Это показывает, что уровень активности ФЛA2 хорошо коррелирует с уровнем перекисного окисления липидов и может охарактеризовать антиоксидантный потенциал крови при использовании известного антиоксиданта Тролокса в качестве стандарта. 

ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЦИТОХРОМА Р450 И ФОСФОЛИПАЗ А2 РАЗНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ, ОБНАРУЖИВАЕМЫЕ КД-СПЕКТРОСКОПИЕЙ

The study of the features of the protein-protein interaction of cytochrome P450 (CYP3A4 and CYP2B4) and phospholipase A2 (PLA2) using circular dichroism spectroscopy was carried out.The divergent effects were found in the change of the CD-spectrum of the mixture of snake venom PLA2–CYP2B4 (ratio 1  : 4 mole/mole) and the mixture of porcine pancreatic PLA2-human CYP3A4 (ratio 1  : 20 mole/mole), as compared to the CD-spectra of the individual protein, respectively, which evidences direct protein-protein interactions of PLA2 and CYP.The resultant CD-spectrum in the first case is characterized by a 2.5-fold increase in the molar ellipticity protein mixture in relation to the molar ellipticity of cytochrome P450, and the second – by a significant reduction of this index, which reflects the significant changes in the conformation of the interaction of these biopolymers.Проведено изучение особенностей белок-белкового взаимодействия цитохромов Р450 (CYP2В4 и CYP3А4) и фосфолипаз А2 (ФЛА2) с использованием спектроскопии кругового дихроизма. Обнаружены разнонаправленные эффекты в изменении спектров KД смеси ФЛА2 яда змеи–CYP2В4 (соотношение 1  :   4 моль/моль) и смеси ФЛА2 поджелудочной железы свиньи–CYP3А4 человека (соотношение 1  : 20 моль/моль) в сравнении со спектрами KД индивидуальных белков соответственно, что свидетельствует о прямом белок-белковом взаимодействии ФЛА2 и CYP. При этом результирующий спектр КД в первом случае характеризуется увеличением в 2,5 раза значений молярной эллиптичности смеси белков по отношению к молярной эллиптичности цитохрома Р450, а во втором – существенным уменьшением этого показателя, что отражает значительные изменения в конформации этих биополимеров при взаимодействии