Молекулярно-генетическая диагностика светлоклеточного почечно-клеточного рака

Background. On the pace of growth in Russia, renal carcinoma takes the 1st place. Approximately one third of patients at time of diagnosis have distant metastases, and relapse of the disease occurs in 30–40 %. Renal carcinoma does not manifest until later stage of the disease. More than in 50 % of cases renal carcinoma is revealed occasionally. Therefore, development of methods for quick and efficient diagnosis of the tumor is actual.Materials and methods. The level of messenger RNA expression for several genes was studied in the surgical material of paired samples (normal tissue and a malignant renal carcinoma). Quantification of gene expression was performed by using real-time polymerase chain reaction on Step One Plus instrument (Applied Biosystems, USA) by using TaqMan® Gene Expression Assays kits (Applied Biosystems, USA).Results. As a result of screening analysis of 200 genes expression in paired samples of renal carcinoma/normal renal tissue we selected 5 genes showing the highest frequency of increased expression in stages I–III of the development of clear renal cell carcinoma: CA9, EGLN3, HIG2, NDUFA4L2, STC2.Conclusion. As a result of the expression study we developed a new panel, including CA9, HIG2 and STC2 genes which has high sensitivity (96.8 %) and specificity (92.9 %) for differential diagnosis of the early clear cell renal cell carcinoma on the basis of determining the level of messenger RNA expression by real-time polymerase chain reaction. This approach allows you to diagnose clear cell renal cell carcinoma quickly (within 1 day), and differentiate it from other types of renal cell cancer. In addition, it opens the possibility of non-invasive diagnosis of renal carcinoma in the future.Введение. По темпу прироста в России рак почки занимает 1-е место. Примерно у трети больных к моменту постановки диагноза выявляют отдаленные метастазы, и у 30–40 % возникает рецидив болезни. Рак почки не проявляется симптоматически до поздней стадии заболевания. Более чем в 50 % случаев рак почки обнаруживают случайно. В связи с этим актуально развитие методов, позволяющих быстро и эффективно диагностировать опухоль.Материалы и методы. Было проведено изучение уровней экспрессии матричной РНК ряда генов в операционном материале парных образцов (нормальная ткань и злокачественная опухоль почки). Количественное определение экспрессии генов осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени на приборе Step One Plus (Applied Biosystems, США) с использованием наборов TaqMan® Gene Expression Assays (Applied Biosystems, США).Результаты. По результатам скринингового анализа экспрессии 200 генов в парных образцах рак почки/нормальная ткань почки выбраны 5 генов, демонстрирующих наибольшую частоту повышенной экспрессии на I–III стадиях развития светлоклеточного почечно-клеточного рака: CA9, EGLN3, HIG2, NDUFA4L2, STC2.Заключение. По результатам проведенного исследования экспрессии разработана новая панель, включающая гены CA9, HIG2 и STC2, которая дает возможность с высокой чувствительностью (96,8 %) и специфичностью (92,9 %) дифференциально диагностировать ранний светлоклеточный рак почки на основе определения уровня матричной РНК методом полимеразной цепной реакции в реальном времени. Такой подход позволяет быстро (в течение 1 дня) диагностировать светлоклеточный почечно-клеточный рак, отличая его отдругих типов почечно-клеточного рака. Кроме этого, он открывает возможность неинвазивной диагностики рака почки в дальнейшем

Сходство и различие процессов метастазирования и дифференцировки рака почки по экспрессии генов

Background. Metastasing and degree of differentiation refer to the main clinical characteristics of malignant tumors. Both listed features need an in-depth study that can lead to an understanding of the mechanisms for the occurrence of certain state of cancer cells.Objective. Studying the processes of metastasis and differentiation of the clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) on gene expression.Materials and methods. The levels of expression of ten genes in 65 paired samples were studied (ccRCC tumor tissue and the normal kidney tissue) by the real-time polymerase chain reaction.Results. It is shown that the expression of CA9, NDUFA4L2, VWF, IGFBP3, BHLHE41, ANGPTL4 and EGLN3 genes is associated both with the degree of differentiation of the ccRCC and with the metastasis of this tumor. C1QA expression is connected only with metastasis, but does not participate in the process of differentiation of tumor cells. An ambiguous situation with FN1 and CSF1R gene expression is not essential for ccRCC metastasis processes, but may have a certain value for differentiation of cells of this tumor. Low-differentiated tumors have about five times an increased metastasis frequency during the year relative to highly differentiated tumors (odds ratio 4.94). A low correlation of gene expression in tumors with a low degree of differentiation is revealed, as opposed to their high co-expression during tumor progression by TNM classifications.Conclusion. A significant part of genes substantial for the development of ccRCC is associated with both metastasis and the degree of differentiation of the ccRCC, which is due to the similarity of functional changes that stimulate both of these processes. For low-differentiated tumors the number of genes with correlated expression is less than in high-differentiated tumors. This may be due to disorganization of gene expression.Введение. Метастазирование и степень дифференцировки относятся к основным клиническим характеристикам злокачественных опухолей. Оба рассматриваемых признака нуждаются в углубленном исследовании, способном приводить к пониманию механизмов возникновения того или иного состояния раковых клеток.Цель исследования - изучение процессов метастазирования и дифференцировки светлоклеточного почечно-клеточного рака (скПКР) по экспрессии генов.Материалы и методы. Изучены уровни экспрессии 10 генов в 65 парных образцах (опухолевая ткань скПКР и нормальная ткань той же почки) методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.Результаты. Показано, что экспрессия генов CA9, NDUFA4L2, VWF, IGFBP3, BHLHE41, ANGPTL4 и EGLN3 ассоциирована как со степенью дифференцировки скПКР, так и с метастазированием этой опухоли. Экспрессия C1QA связана только с метастазированием, но не участвует в процессах дифференцировки клеток опухоли. Неоднозначная ситуация с генами FN1 и CSF1R, экспрессия которых несущественна для процессов метастазирования скПКР, но может иметь некоторое значение для дифференцировки клеток этой опухоли. Низкодифференцированные опухоли имеют примерно в 5 раз повышенную частоту метастазирования в течение года по отношению к высокодифференцированным опухолям (отношение шансов 4,94). Выявлена низкая корреляция экспрессии генов в опухолях с низкой степенью дифференцировки, в противовес их высокой коэкспрессии при прогрессии опухоли по TNM-классификации.Заключение. Значительная часть существенных для развития скПКР генов связана как с метастазированием, так и со степенью дифференцировки опухоли, что обусловлено сходством функциональных изменений, стимулирующих оба этих процесса. В низкодифференцированных опухолях выявлена дезорганизация экспрессии генов, выражающаяся в слабой ее корреляции

Совместное определение экспрессии и метилирования генов для диагностики светлоклеточного почечно-клеточного рака

Background. Clear cell renal cell carcinoma is the most frequent and most aggressive kidney cancer. Approximately 30 % at the initial diagnosis reveal distant metastases. This is due to the fact that kidney cancer in the early stages is asymptomatic. Very often (about 50 %), kidney cancer is detected by chance, during a routine examination or during treatment for other reasons. In this regard, the development of new methods of early diagnosis of clear cell renal cell carcinoma is actual. Materials and methods. The levels of mRNA expression and methylation of a number of genes in the surgical material of paired samples (normal kidney tissue and tumor, 21 clinical cases) were studied. Quantitative determination of gene expression was performed using real-time polymerase chain reaction on a Step One Plus instrument (Applied Biosystems, USA) using TaqMan®Gene Expression Assays (Applied Biosystems, USA). High molecular DNA was isolated from tissue by phenol-chloroform extraction. Methyl-specific polymerase chain reaction was performed on a T100 Thermal Cycler amplifier (Bio-Rad, USA).Results. As a result of joint analysis of the levels of gene expression and methylation, a system of potentially diagnostic markers has been developed, including the determination of the expression of a number of protein coding genes and the hypermethylation of several miRNA genes in tumor samples. Simultaneous determination of expression and methylation allows for the correct identification of tumors as SCRV with a sensitivity of 95.24 % (95 % confidence interval 76.18–99.88 %) and specificity of 95.24 % (95 % confidence interval 76.18–99.88 %). Conclusion. According to the results of the study, a system was developed based on the determination of the expression levels of the CA9, HIG2, EGLN3,  NDUF4L2  genes and the methylation of the MIR9-1, MIR34b/c,  MIR124a-3,  MIR129-2.  Depending on the requirements for sensitivity, reliability of determination, or ease of implementation, various combinations of these genes are possible.Введение. Светлоклеточный почечно-клеточный рак – самый частый и наиболее агрессивный рак почки. Примерно у 30 % пациентов при первичной постановке диагноза выявляют отдаленные метастазы. Это связано с тем, что рак почки на ранних стадиях протекает бессимптомно. Часто (~50 % случаев) рак почки выявляют случайно, при профилактическом осмотре или при обращении по другим причинам.  В связи с этим актуально  развитие  новых методов ранней диагностики  светлоклеточного почечно-клеточного рака.Материалы и методы. Изучены уровни экспрессии матричной РНК и метилирования ряда генов в операционном материале парных образцов (нормальная ткань/опухоль почки; n = 21). Количественное определение экспрессии генов проводили с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени на приборе Step One Plus (Applied Biosystems, США) с использованием наборов TaqMan®Gene Expression Assays (Applied Biosystems, США). Высокомолекулярную ДНК выделяли из ткани методом фенол-хлороформной экстракции. Метилспецифичную полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторe T100 Thermal Cycler (Bio-Rad, США).Результаты. В результате совместного анализа уровней экспрессии и метилирования генов разработана система потенциально диагностических маркеров, включающая определение экспрессии ряда белоккодирующих генов и гиперметилирования нескольких генов микроРНК в образцах опухоли. Одновременное определение экспрессии и метилирования позволяет проводить правильную идентификацию опухолей в качестве cветлоклеточного почечно-клеточного рака с чувствительностью 95,24 % (95 % доверительный интервал 76,18–99,88 %) и специфичностью 95,24 % (95 % доверительный интервал 76,18–99,88 %).Заключение. По результатам проведенного исследования разработана система, основанная на определении уровней экспрессии генов CA9, HIG2, EGLN3, NDUF4L2 и метилирования генов MIR9-1, MIR34b/c, MIR124a-3,  MIR129-2.  В зависимости от требований к чувствительности, надежности определения или простоте выполнения возможны различные сочетания указанных генов

Анализ действия Т-лимфоцитов периферической крови больного на клетки почечно-клеточного рака в модельных системах

Background. The introduction of immunotherapy based on immune checkpoint inhibitors has significantly improve the effectiveness of kidney cancer treatment. Nevertheless, not all patients respond to such treatment and there are no reliable predictive markers. Therefore, the development of a model system for assessing the cellular immune response to a tumor seems to be an urgent task.Aim. Development of a model to assess the T-cell immune response was the focus of this study.Materials and methods. Primary tumor cell culture and peripheral blood T-cell fraction were obtained under standard sterile conditions. T-cell activation were perform via anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. The cell index was assessed using the RTCA xCELLigence biosensor technology (ACEA Biosciences, USA).Results. Tumor and T-cells from the same patient were cultured together to assess the growth rate of the tumor cell population. Measurements were taken at 30-minute intervals. The duration of observation was 24 hours. It has been shown that non-activated T-cells do not affect the proliferative properties of cultured cancer cells. On the contrary, activated T-cells suppressed the proliferative properties of cancer cells, which was associated with an increase in the proportion of Т-cells carrying the HLA-DR receptor (CD3+HLA–DR+) because of activation. Tumor-specific T-cell activity can lead to three consequences: lack of effect, partial suppression of proliferative properties, and complete death of tumor cells. In the latter case, the absence of such cells was determined by flow cytometry.Conclusion. The developed approach makes it possible to evaluate the cytotoxic properties of T cells in relation to tumor cells in a particular patient. The advantage of this method is that the measurement can be carried out in the presence of immune checkpoint inhibitors. The proposed method may be useful for evaluating the treatment regimen within the framework of personalized therapy.Введение. Внедрение современных методов иммунной терапии на основе препаратов, блокирующих иммунные контрольные точки, значительно повысило эффективность лечения. В то же время не у всех больных наблюдается ответ на такое лечение и надежные предиктивные маркеры отсутствуют. Создание модельной системы для оценки Т-клеточного иммунного ответа на опухоль представляется актуальной задачей.Цель исследования – создание модельной системы для оценки Т-клеточного иммунного ответа на клетки рака почки больного.Материалы и методы. Первичную культуру из опухолевой ткани светлоклеточного рака почки получали в стандартных стерильных условиях клеточного бокса. Фракцию Т-клеток периферической крови выделяли из мононуклеарных клеток. Активацию Т-клеток проводили с помощью антител к CD3 и CD28. Оценку изменения показателя «клеточный индекс» выполняли с применением биосенсорной технологии RTCA хCELLigence (ACEA Biosciences, США).Результаты. Полученные клетки опухоли и фракцию Т-клеток от того же больного культивировали совместно в течение 24 ч, анализируя изменения численности клеточной популяции с интервалом 30 мин. Показано, что неактивированные Т-клетки не влияют на пролиферативные свойства культивируемых раковых клеток, в то время как активированные Т-клетки подавляли пролиферативные свойства раковых клеток, что связано с увеличением доли Т-клеток, несущих рецептор HLA-DR (CD3+HLA–DR+) вследствие активации. Оцениваемая опухольспецифичная активность Т-клеток может отсутствовать, проявляться частичным подавлением пролиферативных свойств или приводить к полной гибели опухолевых клеток. В последнем случае отсутствие таких клеток подтверждали методом проточной цитометрии.Заключение. Разработанная система позволяет оценить эффективность действия иммунных Т-клеток для конкретного больного, в том числе в присутствии ингибиторов иммунных контрольных точек, что может быть использовано в качестве прогностической оценки при выборе средств лечения

Метилирование группы генов микроРНК: маркеры прогноза метастазирования почечно-клеточного рака

Background. Renal cell carcinoma (RCC) is asymptomatic up to severe stages and is characterized by a high mortality rate, reaching 90 % with the development of a metastatic process.Objective: to determine the group of microRNA genes, the methylation of which is associated with the progression of the disease, in particular, with metastasis.Materials and methods. Methylation-specific polymerase chain reaction in a representative sample of RCC patients (98 cases) showed an increase in the methylation status of 6 microRNA genes (MIR9-1, MIR9-3, MIR34b/c, MIR130b, MIR1258, MIR107) in tumor DNA samples relative to matched samples of histologically unchanged tissue.Results. For 4 genes (MIR9-1, MIR107, MIR130b, MIR1258), a significant association of methylation with late (III-IV) stages, tumor size, loss of differentiation, and metastasis to lymph nodes or distant organs was shown. These 4 genes were used to compose a potential metastatic prognosis marker system with a clinical sensitivity of 68 % and a specificity of 84 % (area under curve 0.83), which will be applied in the final development of a system for personalized therapy of RCC patients.Conclusion. The association of methylation of the MIR1258 with RCC metastasis has been shown for the first time and is of independent interest as a new promising marker for the prognosis of metastatic relapses.Введение. Почечно-клеточный рак (ПКР) не имеет симптомов вплоть до поздних стадий и характеризуется высокой частотой летальных исходов, достигающей 90 % при развитии метастатического процесса.Цель исследования — определение группы генов микроРНК, метилирование которых ассоциировано с прогрессированием заболевания, в частности с метастазированием.Материалы и методы. Методом метилспецифичной полимеразной цепной реакции на представительной выборке больных ПКР (n = 98) показано повышение статуса метилирования 6 генов микроРНК (MIR9-1, MIR9-3, MIR34b/c, MIR130b, MIR1258, MIR107) в образцах ДНК опухоли относительно парных образцов гистологически неизмененной ткани.Результаты. Для 4 генов (MIR9-1, MIR107, MIR130b, MIR1258) показана ассоциация метилирования с поздними (III-IV) стадиями, размером опухоли, потерей дифференцировки и метастазированием в лимфатические узлы или отдаленные органы. Из этих 4 генов методом ROC-анализа составлен набор маркеров прогноза метастазирования с клинической чувствительностью 68 % и специфичностью 84 % (площадь под ROC-кривой 0,83), который будет применен в окончательной разработке системы для персонализированной терапии больных ПКР.Заключение. Ассоциация метилирования гена MIR1258 с метастазированием ПКР показана впервые и представляет самостоятельный интерес как новый перспективный маркер прогноза метастазирования

Molecular genetic diagnostics of clear cell renal cell carcinoma

Background. On the pace of growth in Russia, renal carcinoma takes the 1st place. Approximately one third of patients at time of diagnosis have distant metastases, and relapse of the disease occurs in 30–40 %. Renal carcinoma does not manifest until later stage of the disease. More than in 50 % of cases renal carcinoma is revealed occasionally. Therefore, development of methods for quick and efficient diagnosis of the tumor is actual.Materials and methods. The level of messenger RNA expression for several genes was studied in the surgical material of paired samples (normal tissue and a malignant renal carcinoma). Quantification of gene expression was performed by using real-time polymerase chain reaction on Step One Plus instrument (Applied Biosystems, USA) by using TaqMan® Gene Expression Assays kits (Applied Biosystems, USA).Results. As a result of screening analysis of 200 genes expression in paired samples of renal carcinoma/normal renal tissue we selected 5 genes showing the highest frequency of increased expression in stages I–III of the development of clear renal cell carcinoma: CA9, EGLN3, HIG2, NDUFA4L2, STC2.Conclusion. As a result of the expression study we developed a new panel, including CA9, HIG2 and STC2 genes which has high sensitivity (96.8 %) and specificity (92.9 %) for differential diagnosis of the early clear cell renal cell carcinoma on the basis of determining the level of messenger RNA expression by real-time polymerase chain reaction. This approach allows you to diagnose clear cell renal cell carcinoma quickly (within 1 day), and differentiate it from other types of renal cell cancer. In addition, it opens the possibility of non-invasive diagnosis of renal carcinoma in the future

A joint determination of gene expression and methylation for the diagnosis of clear cell renal cancer

Background. Clear cell renal cell carcinoma is the most frequent and most aggressive kidney cancer. Approximately 30 % at the initial diagnosis reveal distant metastases. This is due to the fact that kidney cancer in the early stages is asymptomatic. Very often (about 50 %), kidney cancer is detected by chance, during a routine examination or during treatment for other reasons. In this regard, the development of new methods of early diagnosis of clear cell renal cell carcinoma is actual. Materials and methods. The levels of mRNA expression and methylation of a number of genes in the surgical material of paired samples (normal kidney tissue and tumor, 21 clinical cases) were studied. Quantitative determination of gene expression was performed using real-time polymerase chain reaction on a Step One Plus instrument (Applied Biosystems, USA) using TaqMan®Gene Expression Assays (Applied Biosystems, USA). High molecular DNA was isolated from tissue by phenol-chloroform extraction. Methyl-specific polymerase chain reaction was performed on a T100 Thermal Cycler amplifier (Bio-Rad, USA).Results. As a result of joint analysis of the levels of gene expression and methylation, a system of potentially diagnostic markers has been developed, including the determination of the expression of a number of protein coding genes and the hypermethylation of several miRNA genes in tumor samples. Simultaneous determination of expression and methylation allows for the correct identification of tumors as SCRV with a sensitivity of 95.24 % (95 % confidence interval 76.18–99.88 %) and specificity of 95.24 % (95 % confidence interval 76.18–99.88 %). Conclusion. According to the results of the study, a system was developed based on the determination of the expression levels of the CA9, HIG2, EGLN3,  NDUF4L2  genes and the methylation of the MIR9-1, MIR34b/c,  MIR124a-3,  MIR129-2.  Depending on the requirements for sensitivity, reliability of determination, or ease of implementation, various combinations of these genes are possible

Current advances in kidney cancer immunotherapy

In Russia, among tumors of the genitourinary system, renal cell carcinoma takes the 2nd place after prostate cancer. In 25 % of patients at the time of diagnosis, metastases are detected. Treatment of advanced stages of renal cell carcinoma is often not effective enough. The introduction into clinical practice of modern immunotherapeutic drugs based on inhibition of immune check points has changed the prognosis of the disease for many patients with various malignant neoplasms, including kidney cancer. In this article, we described the results of recent clinical trials on the use of immunotherapy in the treatment of kidney cancer. The most effective is combination of drugs that inhibit different immune check points, and a combination of a check point inhibitor with a targeted drug. This approach is likely to be a major one in the treatment of renal cell carcinoma in the short term. Combinations of control point inhibitors with radiation therapy and immunomodulatory drugs, the role of miRNAs in the regulation of expression of immune control points, the significance and characteristics of the microbiome in connection with the success of immunotherapy for kidney cancer, gene expression profiles as biomarkers of the immune response, and other biomarkers are considered. A better understanding of the mechanisms that limit the effectiveness of immune control point inhibitors will improve future treatment