Характеристика эффекторов адаптивного иммунитета, вовлеченных во вторичный ксеногенный иммунный ответ на клетки меланомы человека

Introduction. Current approaches are being developed for adoptive cancer therapy using T-cells genetically modified with T-cell receptors (TCRs) with specificity for tumor antigens. The complexities of identifying antigen-specific TCRs in a patient’s repertoire and selecting therapeutic  receptors necessitate the development of experimental strategies for generating tumor-specific T cells. One of such approaches could be the xenogeneic immunization of mice with human tumor cells. It seems plausible that the T cell repertoire stimulated by xenogeneic vaccination could be a source of TCRs suitable for adoptive cancer immunotherapy.Aim. To assess the prospects for using xenogeneic immunizations to generate tumor-specific memory T cells and identify their TCRs suitable for adoptive immunotherapy, we studied the dynamics of the secondary xenogeneic response in a model of induction of an immune response in mice to human melanoma cells.Materials and methods. Mice were immunized with human melanoma cells, and 45 days later, they were re-challenged with the immunizing tumor. The dynamics of the development of the secondary immune response in vivo and the composition of the involved effectors of adaptive immunity were analyzed by flow cytometry. The proliferation of lymphocytes from immune mice in response to human melanoma cells was evaluated in in vitro culture.Results. The secondary xenogeneic response was characterized by a more intense accumulation of T cells and the rapid development of the effector phase at the injection site of human melanoma. This correlated with an enhanced in vitro proliferative response of lymphocytes from immune animals to xenoantigens of the immunizing tumor. CD4+ and CD8+ memory  T cells contributed equally to the development of a secondary response to human melanoma cells expressing HLA class I and II molecules. When only HLA class I was expressed on the cells of the immunizing xenogeneic tumor, CD8+ memory cells were formed, which dominated the secondary immune response.Conclusion. Our findings confirmed the formation of a specific immunological memory for xenoantigens during xenogeneic immunization. This suggests the possibility of generating xenogeneic TCRs specific for human tumor antigens, which opens up opportunities to developing approaches for screening among them for receptor variants suited for adoptive immunotherapy of human cancers.Введение. В настоящее  время развиваются подходы адоптивной клеточной терапии онкологических заболеваний с использованием Т-клеток, генетически модифицированных Т-клеточными рецепторами (ТКР) со специфичностью к опухолевым антигенам. Трудоемкость идентификации антигенспецифических ТКР в репертуаре пациента и отбора терапевтических рецепторов делает актуальной разработку экспериментальных стратегий генерации опухолеспецифических Т-клеток. Одной из них может быть ксеногенная иммунизация модельных животных клетками опухоли человека. представляется привлекательной идея, что репертуар Т-клеток, стимулированный  ксеногенной иммунизацией, может стать источником для поиска ТКР, пригодных для адоптивной иммунотерапии опухолей человека.Цель исследования  – анализ динамики вторичного ксеногенного ответа в модели индукции иммунного ответа у мышей на клетки меланомы человека для оценки перспектив использования ксеногенных иммунизаций для генерации опухолеспецифических Т-клеток памяти и идентификации их ТКР, подходящих для адоптивной иммунотерапии.Материалы и методы. Мышей иммунизировали клетками меланомы человека; через 45 дней повторно вводили иммунизирующую опухоль. Динамику развития вторичного иммунного ответа in vivo и состав вовлеченных эффекторов адаптивного иммунитета анализировали методом проточной цитофлуориметрии. В культуре in vitro оценивали пролиферативный ответ лимфоцитов иммунных мышей на клетки иммунизирующей и сторонней меланом человека.Результаты. Вторичный ксеногенный ответ характеризовался более интенсивным накоплением Т-клеток и быстрым развитием эффекторной фазы в месте введения меланомы человека. это коррелировало с усиленным пролиферативным ответом in vitro лимфоцитов иммунных животных на ксеноантигены иммунизирующей опухоли. CD4+- и СD8+-Т-клетки памяти вносили  равный  вклад в развитие вторичного ответа на клетки меланомы человека, экспрессирующей молекулы антигенов гистосовместимости (human leukocyte antigens, HLA) классов I и II. При экспрессии только HLA класса I на клетках иммунизирующей ксеногенной опухоли формировались CD8+-клетки памяти, которые доминировали во вторичном иммунном ответе.Заключение. полученные нами данные подтвердили, что в ходе ксеногенной иммунизации формируется специфическая иммунологическая память к ксеноантигенам. Это указывает на возможность генерации ксеногенных ТКР, специфичных к антигенам опухоли человека, и открывает перспективы для разработки стратегий поиска среди них вариантов рецепторов, пригодных для адоптивной иммунотерапии опухолей человека

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ КЛЕТОК ПАМЯТИ CD8+ В УСЛОВИЯХ ЛИМФОПЕНИИ, ВЫЗВАННОЙ ВВЕДЕНИЕМ ГИДРОКОРТИЗОНА

Background. Wide use of glucocorticoids therapy for neoplasms, autoimmune diseases and allergies is associated with suppression of adaptive immunity that requires profound study of their immunoregulatory properties and immunotoxicity.Results. In this work, using our model of selective activation of mouse CD8+ memory cells in the mixed lymphocyte reaction (MLR) in vitro, we show for the first time that intraperitoneal injection of high dose hydrocortisone (2.5 mg per animal) allows to detect memory cells in the thymus of animals immunized with allogeneic tumor cells. Similar to memory cells from other lymphoid organs, hydrocortisone-resistant thymic lymphocytes from immune animals respond on allogeneic stimulators subjected to severe heat shock and are immunologically specific to immunizing alloantigen. Thus, cortisone-resistant thymocytes are partially or completely represented by memory cells. We also show here that memory responses of heterozygotes on TCR a-chain knock-out (genetically incapable to secondary rearrangement of TCR achains) are significantly enhanced as compared with the ones of wild type mice.Conclusion. These findings allows to suggest the hypothesis according to which memory T cell clones proliferating in primary immune response migrate into thymus providing necessary microenvironment for reexpression of recombinases. After editing of genes encoding TCR achains, such T lymphocytes can return to peripheral repertoire maintaining its wideness.Введение. Широкое применение глюкокортикоидов в терапии онкологических, аутоиммунных и аллергических заболеваний сопряжено с подавлением функций адаптивного иммунитета и ставит задачу углубленного исследования их иммунорегуляторных свойств и иммунотоксичности.Результаты. Используя разработанную нами модель селективной активации мышиных клеток памяти CD8+ в смешанной культуре лимфоцитов (mixedlymphocytereaction, MLR) invitro, в этой работе мы впервые показали, что внутрибрюшинное введение мышам гидрокортизона в высокой дозе (2,5 мг на 1 животное) позволяет обнаружить Т-клетки памяти в тимусе животных, иммунизированных клетками  аллогенной опухоли. Как и клетки  памяти из других лимфоидных органов, лимфоциты тимуса иммунных животных, резистентные к гидрокортизону, отвечают пролиферацией на аллогенные стимуляторы, подвергнутые острому тепловому шоку и иммунологически специфичны к иммунизирующему аллоантигену. Таким образом, кортизонрезистентные тимоциты частично или полностью представлены клетками памяти. Также мы показали, что у гетерозигот по нокауту α-цепи TCR (генетически неспособных ко вторичной реаранжировке α-цепей) ответы клеток памяти значительно усилены по сравнению с ответами клеток памяти мышей дикого типа.Заключение. Полученные данные позволяют выдвинуть гипотезу, согласно которой клоны Т-клеток памяти, размножившиеся в первичном иммунном ответе, мигрируют в тимус, обеспечивающий микроокружение, необходимое для реэкспрессии ими рекомбиназ. После завершения редактирования α-цепей TCR такие Т-лимфоциты могут вернуться в периферический репертуар, поддерживая его широту

Metabolic aspects of adoptive immunotherapy of tumors

In wide number of approaches to treatment of cancer immunotherapy plays special role. This approach exploits capabilities of immune system to support genetic constancy of different cells and tissues of the organism. Immunotherapy is designed to induce tumor cell destruction  by T-lymphocytes whose receptors can recognize peptides of mutant proteins complexed with the molecules of the major histocompatibility complex. In clinical practice T-lymphocytes can result in sustained and complete responses in patients whose cancers were resistant to available treatment options. Recent evidences suggest that efficiency of such therapy generally depends on metabolic properties of T-lymphocytes. A number of approaches allows modulate T-cell metabolism providing strategies to optimize activity of anti-tumor T-lymphocytes

FUNCTIONAL CAPACITY OF MEMORY CELLS CD8+ UNDER LYMPHOPENIA INDUCED BY INJECTION OF HYDROCORTISONE

Background. Wide use of glucocorticoids therapy for neoplasms, autoimmune diseases and allergies is associated with suppression of adaptive immunity that requires profound study of their immunoregulatory properties and immunotoxicity.Results. In this work, using our model of selective activation of mouse CD8+ memory cells in the mixed lymphocyte reaction (MLR) in vitro, we show for the first time that intraperitoneal injection of high dose hydrocortisone (2.5 mg per animal) allows to detect memory cells in the thymus of animals immunized with allogeneic tumor cells. Similar to memory cells from other lymphoid organs, hydrocortisone-resistant thymic lymphocytes from immune animals respond on allogeneic stimulators subjected to severe heat shock and are immunologically specific to immunizing alloantigen. Thus, cortisone-resistant thymocytes are partially or completely represented by memory cells. We also show here that memory responses of heterozygotes on TCR a-chain knock-out (genetically incapable to secondary rearrangement of TCR achains) are significantly enhanced as compared with the ones of wild type mice.Conclusion. These findings allows to suggest the hypothesis according to which memory T cell clones proliferating in primary immune response migrate into thymus providing necessary microenvironment for reexpression of recombinases. After editing of genes encoding TCR achains, such T lymphocytes can return to peripheral repertoire maintaining its wideness

Трансплантационный и специфический противоопухолевый иммунитет в ретроспективе: новые модели, основанные на трансгенезе индивидуальных цепей Т-клеточного рецептора

Findings in experimental oncology in beginning of last century and subsequent achievements of genetics of tissue compatibility resulted in divergence of transplantational immunology and oncoimmunology. However, central achievements of both scientific fields are based on unified phenomenon of interaction between T-cell receptor (TCR) and histocompatibility molecules. In this review we describe the history of ideas, achievements and unique experience of the team of the Laboratory of Regulatory Mechanisms in Immunity at Scientific Research Institute of Carcinogenesis, N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center for all time of existence. This experience shows that efficiency of immunological defense including immunological surveillance are critically influenced by T-cell receptor repertoire. Transgenesis of individual chains of TCR is one of possible means to manage T-cell repertoire. Functional outcomes of transgenesis may be different due to diverse extent of dependence of α- and β-chains expression on the rules of allelic exclusion. Expression of transgenic β-chains results in the expansion of TCR repertoire diversity. Expression of β-chains is under strong control by allelic exclusion, resulting in formation of repertoire bearing mainly invariant transgenic β-chain pared with different α-chains and overall narrowing of repertoire. Earlier, we cloned genes encoding α- and β-chains of TCR of CD8+ memory cells specific to histocompatibility molecule H-2Kb . After introduction them in zigotes we have obtained transgenic mouse strains, which could be used for modeling of interactions between tumor cells and immune system of recipient. Normally, B10. D2 (R101) mice reject lymphoma EL4 cells in 12–14 days after transplantation, in spite of the fact, that allogeneic difference between B10. D2 (R101) (Kd Id Db ) mice and lymphoma EL4 (H-2b) cells is only in one product of MHC, the H-2Kb molecule. Transgenics carrying β-chains of TCR displayed compromised immunity to tumor cells resulting to their long persistence, tumor progression, the loss of H-2Kb molecule and death in 2–3 months after transplantation. This model allows to see all three phases of interaction between tumor and immune system of recipient – elimination, equilibrium and escape. Against, transgenics carrying α-chain reject tumor cells much more quickly, as in secondary immune response, in 3–6 days after transplantation. This rejection was mediated by intraepithelial T lymphocytes displaying features of resident memory cells – inability to recirculation, expression of CD103 and early activation antigen CD69 and intermediate density of T-cell markers CD3 and CD8. The capability to be located in nonlymphoid tissue and quickly destroy tumor cells makes them to be the most probable candidate to perform immunological surveillance functions.Открытия экспериментальной онкологии начала прошлого века и достижения генетики тканевой совместимости привели к разделению и последующему независимому развитию иммунологии тканевой совместимости и онкоиммунологии. Вместе с тем центральные достижения обеих дисциплин основываются на едином феномене взаимодействия Т-клеточного рецептора (Т-cell receptor, TCR) с молекулами главного комплекса гистосовместимости. В настоящем обзоре мы описываем историю становления идей, достижения и уникальный опыт, полученный сотрудниками лаборатории механизмов регуляции иммунитета НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина. Этот опыт свидетельствует о том, что репертуар TCR и особенности их структуры критически влияют на эффективность иммунологической защиты организма, включая иммунологический надзор над возникновением и ростом клонов злокачественных клеток. Одним из возможных путей направленного воздействия на репертуар Т-лимфоцитов является трансгенез индивидуальных цепей TCR на уровне зиготы. Функциональные последствия такого трансгенеза различны в связи с тем, что экспрессия α- и β-цепей в разной степени подчинена правилам аллельного исключения. Экспрессия α-цепей ими не контролируется и поэтому приводит к расширению репертуара TCR. Экспрессия β-цепей строго подчинена правилам аллельного исключения, в связи с чем экспрессия трансгена β-цепи приводит к образованию репертуара рецепторов, в подавляющем большинстве которых присутствует трансгенная β-цепь, сужающая разнообразие репертуара. Ранее нами были клонированы гены β- и α-цепей TCR-клеток памяти CD8+, специфичных к молекуле главного комплекса гистосовместимости H-2Kb . В результате их внесения в геном оплодотворенной яйцеклетки нами были получены трансгенные линии животных, которые можно использовать для моделирования взаимодействий опухолевых клеток с иммунной системой опухоленосителя. Мыши линии B10. D2 (R101) в норме отторгают клетки лимфомы EL4 в течение 12–14 дней, несмотря на то, что трансплантационные различия клеток опухоли и клеток хозяина представлены единственной молекулой гистосовместимости H-2Kb . В отличие от них животные, несущие трансгены β-цепи, имеют ослабленный иммунитет к клеткам опухоли, который приводит к их длительной персистенции в организме, сопровождающейся прогрессией, необратимой утратой опухолевыми клетками молекулы H-2Kb и гибелью животных через 2–3 мес после трансплантации им опухолевых клеток. В этой модели удается проследить все 3 фазы взаимодействия опухоли с иммунной системой опухоленосителя – элиминацию, равновесие и ускользание, в ходе которых опухолевые клетки под давлением иммунной системы реципиента утрачивают экспрессию молекулы H-2Kb и в итоге убивают опухоленосителя. Трансгены α-цепи, напротив, ускоренно отторгают опухолевые клетки в течение 3–6 дней с динамикой вторичного иммунного ответа. В отторжение этого типа вовлечены интраэпителиальные Т-лимфоциты, обладающие свойствами резидентных клеток памяти, – неспособностью к рециркуляции, экспрессией интегрина CD103, раннего активационного антигена CD69 и промежуточным уровнем экспрессии Т-клеточных маркеров CD3 и CD8. Способность этих клеток локализоваться в тканях и быстро уничтожать опухолевые клетки делают эту субпопуляцию наиболее вероятным носителем функций иммунологического надзора

Метаболические аспекты адоптивной иммунотерапии опухолей

In wide number of approaches to treatment of cancer immunotherapy plays special role. This approach exploits capabilities of immune system to support genetic constancy of different cells and tissues of the organism. Immunotherapy is designed to induce tumor cell destruction  by T-lymphocytes whose receptors can recognize peptides of mutant proteins complexed with the molecules of the major histocompatibility complex. In clinical practice T-lymphocytes can result in sustained and complete responses in patients whose cancers were resistant to available treatment options. Recent evidences suggest that efficiency of such therapy generally depends on metabolic properties of T-lymphocytes. A number of approaches allows modulate T-cell metabolism providing strategies to optimize activity of anti-tumor T-lymphocytes.В широком ряду методов лечения онкологических заболеваний особое место принадлежит иммунотерапии – терапевтическому подходу, использующему возможности иммунной системы организма в поддержании генетического постоянства его клеток и тканей. Иммунотерапия нацелена на то, чтобы вызывать разрушение опухолевых клеток Т-лимфоцитами, чьи рецепторы способны распознать пептиды мутантных белков, связанные с молекулами главного комплекса гистосовместимости. В клинической практике Т-лимфоциты способны вызывать стойкое улучшение и даже полное излечение больных, опухоли которых устойчивы к другим доступным методам лечения. Ряд работ, появившихся в последние годы, указывают на то, что эффективность такой терапии в значительной степени зависит от процессов энергетического метаболизма Т-лимфоцитов. Существуют несколько подходов, способных модулировать метаболизм Т-лимфоцитов и достичь оптимального проявления их противоопухолевых свойств

Physiological and Functional Effects of Dominant Active TCRα Expression in Transgenic Mice

A T cell receptor (TCR) consists of α- and β-chains. Accumulating evidence suggests that some TCRs possess chain centricity, i.e., either of the hemi-chains can dominate in antigen recognition and dictate the TCR’s specificity. The introduction of TCRα/β into naive lymphocytes generates antigen-specific T cells that are ready to perform their functions. Transgenesis of the dominant active TCRα creates transgenic animals with improved anti-tumor immune control, and adoptive immunotherapy with TCRα-transduced T cells provides resistance to infections. However, the potential detrimental effects of the dominant hemi-chain TCR’s expression in transgenic animals have not been well investigated. Here, we analyzed, in detail, the functional status of the immune system of recently generated 1D1a transgenic mice expressing the dominant active TCRα specific to the H2-Kb molecule. In their age dynamics, neither autoimmunity due to the random pairing of transgenic TCRα with endogenous TCRβ variants nor significant disturbances in systemic homeostasis were detected in these mice. Although the specific immune response was considerably enhanced in 1D1a mice, responses to third-party alloantigens were not compromised, indicating that the expression of dominant active TCRα did not limit immune reactivity in transgenic mice. Our data suggest that TCRα transgene expression could delay thymic involution and maintain TCRβ repertoire diversity in old transgenic mice. The detected changes in the systemic homeostasis in 1D1a transgenic mice, which are minor and primarily transient, may indicate variations in the ontogeny of wild-type and transgenic mouse lines