A szekurin-szeparáz rendszer szerkezeti-funkcionális jellemzése = Structural and functional characterisation of the securin-separase system

A munkaterv azt a célt tűzte ki, hogy a sejtciklusban fontos szerepet játszó szeparáz enzim és rendezetlen inhibítora (szekurin) részletes szerkezeti elemzésén keresztül közelebb jutunk a rendezetlen fehérjék funkciójának jobb megértéséhez. Ezen tervek nagyrészt megvalósultak, elsősorban a humán szekurin klónozását, és részletes szerkezeti jellemzését sikerült megoldanunk, ezen eredményeket két cikkben publikáltuk. Elkészültünk többféle szekurin (S. cerevisiae, D. melanogaster és humán) összehasonlító szerkezeti vizsgálatával is, ezen eredmények publikációja folyamatban van. A szeparáz enzim katalitikus doménjének klónozása sikerült, nagyszámú konstrukció készült és több is jól kifejeződő fehérjét eredményezett, amelyek aktivitását azonban nem tudtuk mérni. A munkát folytatjuk, folyamatban van egyrészt a fehérje különböző körülmények közötti kifejezése, denaturációja és renaturációja, és aktív formában való előállítása, másrészt nemzetközi együttműködésben Prof. Darren Hart-tal (EMBL Grenoble) az ESPRIT (Expression of Soluble Proteins by Random Incremental Truncation) könyvtár-szűrési technika alkalmazása oldható és aktivitást mutató szeparáz konstrukció létrehozására. A fehérjék szerkezeti rendezetlenségének vizsgálata eközben számos más területeken is hatékonyan folyt, az OTKA K60694 pályázat támogatásának összesen 19 publikáció jelent meg. | The main goal of the proposed work was the detailed structure-function characterization of separase, a key enzyme in cell-cycle regulation and its intrinsically disordered inhibitor, securin. We planned to clone and isolate the two proteins, characterize their structure and interaction with particular focus on the disordered structural state of securin. We achieved part of this goal, mostly the cloning, expression and structural characterization by NMR of human securin, which was published in two papers. We also completed the comparative structural study of three different securins (S. cerevisiae, D. melanogaster and human), which is under publication. We managed to clone and express several constructs of the catalytic domain of separase, which resulted in soluble forms of the protein, without enzymatic activity, though. We continue this research by varying expression conditions, including denaturation-renaturation cycles to produce active separase, and also by an international collaboration with Prof. Darren Hart-tal (EMBL Grenoble) with the application of the ESPRIT (Expression of Soluble Proteins by Random Incremental Truncation) technique in order to generate enzymatically active separase. Besides studies on the securin-separase system, we have carried out many other lines of productive research on intrinsically disordered proteins with the help of OTKA K60694 grant: we published 19 papers with acknowledging the grant

A kalpainok szerkezete, működése, élettani és kórtani szerepe = Structure and function of calpains, physiological and pathological roles

Calpains, the intracellular calcium-activated regulatory proteases are at crossroads of cellular pathways. Our aim has been to unravel the molecular interactions underlying function, both physiological and pathological. In resting cells calpains are inactive, but they are switched on by a rise in calcium concentration. We described the intramolecular structural changes accompanying these transitions. Mammalian calpain have a specific endogenous inhibitor protein, calpastatin. Based on the interaction of calpain and calpastatin, we developed a synthetic, membrane-permeable activator for calpains in intact cells. With this unique reactant, we succeded in activating calpain in living nerve cells, without a gross rise in calcium concentration. | A kalpainok, az intracelluláris kalcium aktivált szabályozó proteázok, sok sejtszintű folyamatban részt vesznek. Célul tűztük ki, hogy feltárjuk az enzim molekuláris kölcsönhatásait, ezáltal mind fiziológiás és patológiás funkcióját. A nyugalmi sejtekben a kalpain inaktív, de a kalcium koncentráció növekedésének hatására aktívvá válik. Munkánk során leírtuk ezen átalakulás intramolekuláris szerkezeti vonatkozásait. Az emlős kalpainok specifikus endogén inhibítora a kalpasztain. A kalpain-kalpasztatin kölcsönhatáson alapulva kifejlesztettünk egy intakt sejtekben is működő szintetikus, membrán-permeábilis aktivátort. Ennek az egyedülálló reaktánsnak a segítségével, képesek vagyunk élő idegsejtekben a kalpain aktiválására, az intracelluláris kalcium koncentráció megemelése nélkül

Rendezetlen fehérjék: a szerkezet-funkció paradigma kiterjesztése = Intrinsically disordered proteins: extension of the structure-function paradigm

Kísérletes eredmények: Rendezetlen chaperonok hatása, a riboszomális fehérjék kettős chaperone hatásának kimutatása. A rendezetlen fehérjék ellenállnak a hideg-denaturációnak. A rendezetlen fehérjéknek egyedi a hidratációja. Rendezetlenség kimutatása liofilizált mintákból. A rendezetlenség korrelál a kromoszómális transzlokációval. Az állványfehérjéknek magas a rendezetlensége. Új NMR technika a rendezetlen fehérjék elemzésére. Az ERD14 NMR jelhozzárendelése és szerkezeti-dinamikai jellemzése. Az androgén receptor rendezetlen régiójának hossza kapcsolatban van a kognitív képességekkel. A rendezetlen fehérjék crowding körülmények között sem tekerednek fel. Elméleti megfigyelések: Kötött állapotban megfigyelhető rendezetlenség (bolyhsosság) elemzése, a domén koncepció kiterjesztése a rendezetlenségre, az amiloidokban mutatkozó rendezetlenség leírása. Bioinformatikai eredmények: A hipertermofil baktériumokban a rendezetlenség aránya alacsony. Az alternatív splicing során kialakuló kettős kódolású szakaszokról átíródó fehérjék rendezetlensége teszi lehetővé az alternatív fehérjék létét. A rendezetlenség közvetlen kapcsolatban van a fehérje funkciójával, így harmadlagos szerkezeti elemnek tekinthető. Predikciós módszer kidolgozása az alternatív splicing során létrejövő fehérje életképességének megállapítására. A poty-vírus VPg sokféle funkcióban vesz részt, köszönhetően szerkezeti flexibilitásának. Egyéb eredmények: Review a rendezetlenség kutatásának új szakaszáról. | Experimental results: Study of the disordered chaperones, the determination of the double chaperone effect of ribosomal proteins, resistance of the IDPs to cold denaturation. Determination of the unique hydration of IDPs. Determination of protein disorder from lyophilized samples. Protein disorder correlates with chromosomal translocation. Scaffold proteins contain a high level of structural disorder. Designing a new NMR method for the study of IDPs. Assignation of NMR signals of ERD14 and its structural-dynamics characterization. The observation that the length of the disordered region of androgen receptor is related to cognitive capabilities. IDPs remain unfolded even under crowding conditions. Theoretical observations: Analysis of disorder in the bound form (fuzziness), extending the domain concept to IDPs, description for disorder in amyloids. Bioniformatical results: Observation of low levels of disorder in hyperthermophil bacteria. Alternative protein forms are able to evolve because of the disordered nature of the transcripts of dual coding sequences, that result from alternative splicing. Disorder is in intimate connection to function, thus it should come under the category of tertiary structural elements. Designing a prediction method to determine the viability of a protein from an alternative splice event. The VPg protein of poty virus possesses many different functions, thanks to its structural flexibility. Other results: Review of the new era of disorder research

Jelfeldolgozás a sejtben: a kalpain és protein kináz rendszerek és kölcsönhatásaik = Intracellular signal processing: the calpain and protein kinase/phosphatase systems, and their interactions

1. Bizonyítottuk, hogy a kalpain B aktív és inaktív formája foszforilálható PKA, ERK1 és ERK2 kinázokkal, azonosítottuk az in vitro foszforilációs helyeket, és meghatároztuk a foszforilált fehérje megváltozott enzimológiai paramétereit. 2. Előállítottuk az összes Drosophila kalpain elleni antitestet. 3. Kidolgoztunk egy háromdimenziós elektroforetikus eljáráson alapuló, in vivo szubsztrát azonosításra használható módszert, amelynek segítségével számos kalpain szubsztrátot azonosítottunk. 4. Kifejlesztettünk egy sejtpenetráns, szintetikus kalpain szubsztrátot, amely a jelenleg ismert szubsztrátok közül a legérzékenyebb. 5. Kifejlesztettünk egy sejtpenetráns, szintetikus kalpain-aktiváló peptid párt, amely a kalpainok sejten belüli, calcium-mentes és specifikus aktiválására képes. 6. Kimutattuk, hogy patkány hippokampális agyszeletekben a kalpainok specifikus aktiválása az alap-ingerlékenység és az LTP szignifikáns növekedését idézi elő. 7. Kalpain A, kalpain B és kalpain A/B mutáns Drosophila vonalakat állítottunk elő. Elemeztük a fehérjék expresszióját vad és mutáns vonalakban, továbbá vizsgáltuk a fenotípusra gyakorolt hatásukat. A kalpain B fehérjéről megállapítottuk, hogy fontos szerepet játszik a határsejtek vándorlásában. 8. Drosophila kalpain interferencia vonalakat állítottunk elő: a kalpain B csendesített vonalak egyedei csökkent fertilitásúak voltak, a kettős mutánsok szintetikus szemiletalitást mutattak. A kalpain C hiánya letalitást okozott. | 1. We provided evidence that both the active and inactive forms of calpain B can be phosphorylated by PKA, ERK1 and ERK2. Phosphorylation sites were localized and the enzymological parameters of the modified enzymes were determined. 2. Antibodies have been generated against all forms of Drosophila calpain. 3. A new three-dimensional electrophoresis method has been developed to identify calpain substrates in vivo. Several novel substrates have been identified. 4. A synthetic, cell-permeable synthetic calpain susbtrate has been developed. This compound is more sensitive to the enzyme than any other known calpain substrate. 5. A peptide pair capable of calpain activation have also been developed. These sythetic peptides can penetrate cells and activate the enzyme in a calcium-independent manner. 6. It has been shown that specific activation of calpain(s) leads to a significantly incerased basal excitability and long-term potentiation (LTP) in rat hippocampal slices. 7. Drosophila lines mutant in calpain A, calpain B and calpain A/B have been generated. The effect of changes in calpain expression on phenotype was tested and it was found that calpain B plays a major role in regulating the migration of border cells. 8. Interference strains of Drosophila have also been generated. We found that silencing calpain B causes reduced fertility whereas double mutation causes synthetic semilethality. Calpain C deficit was found to be lethal