Sodium hydrosulfide moderately alleviates the hallmark symptoms of Duchenne muscular dystrophy in mdx mice

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is an incurable disease caused by mutations in the X-linked DMD gene that encodes a structural muscle protein, dystrophin. This, in turn, leads to progressive degeneration of the skeletal muscles and the heart. Hydrogen sulfide (H2S), the pleiotropic agent with antioxidant, anti-inflammatory, and pro-angiogenic activities, could be considered a promising therapeutic factor for DMD. In this work, we studied the effect of daily intraperitoneal administration of the H2S donor, sodium hydrosulfide (NaHS, 100 μmol/kg/day for 5 weeks) on skeletal muscle (gastrocnemius, diaphragm and tibialis anterior) pathology in dystrophin-deficient mdx mice, characterized by decreased expression of H$_{2}$S-generating enzymes. NaHS reduced the level of muscle damage markers in plasma (creatine kinase, lactate dehydrogenase and osteopontin). It lowered oxidative stress by affecting the GSH/GSSG ratio, up-regulating the level of cytoprotective heme oxygenase-1 (HO-1) and down-regulating the NF-κB pathway. In the gastrocnemius muscle, it also increased angiogenic vascular endothelial growth factor ($\textit{Vegf}$) and its receptor ($\textit{Kdr}$) expression, accompanied by the elevated number of α-SMA/CD31/lectin-positive blood vessels. The expression of fibrotic regulators, like Tgfβ, Col1a1 and Fn1 was decreased by NaHS in the tibialis anterior, while the level of autophagy markers (AMPKα signalling and Atg genes), was mostly affected in the gastrocnemius. Histological and molecular analysis showed no effect of H$_{2}$S donor on regeneration and the muscle fiber type composition. Overall, the H$_{2}$S donor modified the gene expression and protein level of molecules associated with the pathophysiology of DMD, contributing to the regulation of oxidative stress, inflammation, autophagy, and angiogenesis

The effect of apelin on expression of selected apoptotic proteins in cells of human BeWo placental cell line

Apoptoza odgrywa istotną funkcję w kontrolowaniu prawidłowego rozwoju, przebudowy oraz starzenia się łożyska. Ponadto wykazano, że poziom apoptozy wzrasta wraz z przebiegiem ciąży. Regulacja procesu apoptozy, przez różnorodne czynniki umożliwia utrzymanie prawidłowego rozwoju, różnicowania i funkcji łożyska podczas ciąży, a zaburzenie tego procesu może prowadzić do wystąpienia poważnych patologii łożyska, takich jak stan przedrzucawkowy. Apelina – białko o masie 35 kDa będące ligandem dla receptora APJ, zaliczana jest do rodziny adipokin i ulega ekspresji w wielu tkankach organizmu, w tym łożyska. Ostatnimi czasy liczne badania wskazują na jej udział w regulacji procesu apoptozy oraz proliferacji; wykazano, że system apelina/APJ obniża apoptozę w różnych tkankach, w tym komórkach śródbłonka, kardiomiocytach oraz osteoblastach. W związku z tym celem niniejszej pracy było zbadanie wpływu apeliny na ekspresję kluczowych białek apoptozy w komórkach ludzkiej linii łożyska BeWo, stanowiących odpowiedni model do badania trzeciego trymestru ciąży. Metodą western blot przeprowadzono detekcję białek kaspazy-3, -8, -9, p53, Bcl-2 i Bax w zależności od dawki apeliny (2 ng/ml, 20 ng/ml) i czasu inkubacji (24h, 48h, 72h). Analiza western blot i densytometryczna wykazały, że podanie apeliny obniża poziom białek pełnej długości kaspazy-9 (46 kDa), kaspazy-8 (50 kDa) oraz kaspazy-3 (35 kDa) po 24h i 48h, nie obserwowano jednak wpływu na poziom ekspresji żadnej z badanych kaspaz po 72h inkubacji z apeliną. Ponadto wykazano obniżenie poziomu białka p53 po 48h i 72h inkubacji oraz odnotowano wzrost w stosunku białek Bcl-2/Bax po 24h oraz 48h inkubacji z apeliną. Podsumowując, uzyskane wyniki wskazują, że apelina pełni funkcje regulatorowe w procesie apoptozy w łożysku, poprzez wpływ na ekspresję kluczowych białek apoptotycznych, przez co może być potencjalnym czynnikiem biorącym udział w patofizjologii łożyska.Apoptosis plays an important role in the normal development, remodeling and aging of the placenta. Moreover, it has been demonstrated that apoptosis increases as pregnancy progresses. Regulation of apoptotic events by numerous factors is important to allow a correct development, differentiation and function of the placenta throughout pregnancy and that an unbalance of this process leads to severe pathologies such as preeclampsia. Apelin – a 35 kDa protein, which is a ligand for the APJ receptor, belongs to the adipokine family and is produced in many tissues, including placenta. Recently, numerous studies indicate its role in the regulation of apoptosis and proliferation. The apelin/APJ system has been shown to reduce apoptosis in a variety of tissues, including endothelial cells, cardiomyocytes and osteoblasts. Therefore, the aim of this study was to investigate the effect of apelin on the expression of key apoptosis proteins in human BeWo placental cell line, which is an appropriate model for investigating the third trimester of pregnancy. Western blot detection of caspase-3, -8, -9, p53, Bcl-2, Bax proteins was performed depending on the apelin dose (2 ng/ml, 20 ng/ml) and incubation time (24h, 48h, 72h). Western blot and densitometric analysis showed that the administration of apelin reduces the level of full-length caspase-9 (46 kDa), caspase-8 (50 kDa) and caspase-3 (35 kDa) proteins after 24h and 48h, but no effect was observed after 72h incubation with apelin. In addition, there was a reduction in p53 protein levels after 48h and 72h incubation, and an increase in the Bcl-2/Bax protein ratio after 24h and 48h incubation with apelin was noted. In conclusion, the results obtained indicate that apelin regulate the process of placental apoptosis, by affecting the expression of key apoptotic proteins and may be a potential factor involved in placental pathophysiology

Evaluation of the development of cutaneous infection induced by Staphylococcus aureus in neutropenic mice

Szczególna rola neutrofili, związana jest z ich zdolnością do uśmiercania patogenów chorobotwórczych poprzez różnorodne mechanizmy. Rekrutacja neutrofili z krążenia w miejsce infekcji stanowi wyznacznik prawidłowej odpowiedzi przeciwbakteryjnej, a spadek poziomu neutrofili, określany jako neutropenia predysponuje do infekcji. Jednym z najczęstszych miejsc infekcji bakteryjnych u pacjentów z neutropenią jest skóra, a infekcje te często powodowane są przez bakterie gatunku Staphylococcus aureus. Problem w leczeniu zakażeń gronkowcowych, wynika z występowania szczepów lekoopornych oraz zdolnych do produkcji licznych czynników wirulencji. Dlatego celem niniejszej pracy była analiza wpływu obniżonego poziomu neutrofili na rozwój infekcji skórnej wywołanej przez bakterie S. aureus w modelu mysim. Celem obniżenia poziomu neutrofili myszy poddano iniekcji przeciwciałami anty-Ly6G, a infekcję wywołano poprzez powierzchniowe nacięcia na skórze myszy oraz podanie szczepu bakterii S. aureus USA300 JE2 w dawce 2x106 CFUs (ang. colony forming units). Analiza rozwoju infekcji wykonana poprzez ocenę liczby bakterii w zakażonej tkance metodą manualną i automatyczną, nie wykazała wpływu obniżonego poziomu neutrofilii na wzrost bakterii oraz ich morfologię. Pogłębiona analiza qPCR ekspresji genów czynników wirulencji gronkowca, wykazała obniżenie mRNA g-hemolizyny A oraz stafyloksantyny w wyniku spadku neutrofili. Ocena zakażonej tkanki in vivo, ukazała gorszy obraz przebiegu gojenia rany u myszy neutropenicznych, przy czym analiza histologiczna nie wykazała różnic w nacieku leukocytów do miejsca infekcji względem myszy kontrolnych. Analiza biochemiczna wykazała tendencję spadkową aktywności MPO w procesie chlorynacji, przy braku różnic w aktywności elastazy. Szczegółowa analiza qPCR ekspresji genów w skórze, wykazała fenotyp prozapalny u myszy neutropeniczych, z istotnie podwyższonymi poziomami mRNA IL-6, IL-1b, TNF, IFN-g, co wskazuje na kompensację spadku neutrofili wzmożoną odpowiedzią cytokinową, z dodatkowym wzrostem CXCL2, Mmp9, ważnych dla ich rekrutacji. Co ciekawe, wykazano działanie immunomodulacyjne obniżonego poziomu neutrofili, wpływające na wzrost ekspresji genu markera populacji makrofagów M2 (Ym1), wraz ze wzrostem charakterystycznych dla M2 cytokin IL-10 oraz TGF-b. Wyniki te dostarczają szczegółowej wiedzy na temat wpływu obniżonego poziomu neutrofili na przebieg infekcji naskórka przez bakterie S. aureus u myszy i w przyszłości powinny być kontynuowane na liczniejszej grupie myszy oraz z zastosowaniem dodatkowych grup kontrolnych.The special role of neutrophils is related to their ability to kill pathogens through various mechanisms. Recruitment of neutrophils from the circulation to the site of infection is an indicator of a proper antibacterial response, and a decrease in the level of neutrophils, referred as neutropenia, predisposes to infection. One of the most frequent site of bacterial infections in neutropenic patients is skin. Those infections are often difficult to defeat especially when induced by Staphylococcus aureus. Recently, the urgent clinical problem is the presence of multi-drug resistant strains, which produce numerous virulence factors. Therefore, the aim of this study was to analyze the effect of neutrophil depletion on the development of skin infection caused by S. aureus in a mouse model. To reduce the level of neutrophils, mice were injected with anti-Ly6G antibodies and the cutaneous infection was induced through superficial incisions in the skin, followed by administration of the S. aureus USA300 JE2 strain (2x106 CFUs). The analysis of the number of bacteria in the infected tissue was performed with the manual and automatic methods, which showed no effect of neutrophil depletion on the morphology and growth of bacteria. An in-depth qPCR analysis of the gene expression of staphylococcal virulence factors showed a decrease in the mRNA level of the g-hemolysin A and the staphyloxanthine as a result of a neutrophil depletion. In vivo evaluation of the infected tissue showed a deterioration of wound healing process in neutropenic mice, while histological analysis revealed no difference in leukocyte infiltration to the site of infection compared to control mice. Biochemical analysis indicated the decrease of MPO activity in the chlorination process, with no differences in elastase activity. Detailed qPCR analysis of gene expression in the skin revealed a pro-inflammatory phenotype of neutropenic mice, with significantly elevated levels of IL-6, IL-1b, TNF, IFN-g mRNA. Such profile indicates compensation of the neutrophil depletion by an enhanced cytokine response, along with increase in CXCL2, Mmp9, mediators important for neutrophil recruitment. Interestingly, the immunomodulatory effect of the neutrophil depletion has been demonstrated, resulting in increased level of Ym1, the marker of the M2 macrophage polarization. The result corroborates with the increase of IL-10 and TGF-b, cytokines characteristic for M2. These results provide a more detailed understanding of the effect of neutrophil depletion on the course of cutaneous S. aureus infection in mice model and should be continued in the future in a larger group of mice with additional control groups

Expression of chemerin and its receptors in porcine ovary cells depending on the phase of the estrous cycle.

Chemeryna (RARRES2) białko o masie 16 kDa, będące ligandem dla trzech receptorów: CMKLR1, CCRL2, GPR1. Chemeryna jest nową adipokiną, zaangażowaną w regulację adipogenezy, metabolizm glukozy oraz procesy zapalne. Ostatnie badania donoszą, że ulega ona ekspresji w jajniku, wpływając na funkcjonowanie układu rozrodczego. Wykazano hamujący wpływ RARRES2 na procesy steroidogenezy w jajniku szczurzym, ludzkim oraz bydlęcym. Z tego względu praca ta miała na celu zbadanie ekspresji chemeryny i jej receptorów w komórkach jajnika świni w zależności od fazy cyklu estralnego. Detekcja białek w pęcherzykach jajnikowych, znajdujących się w różnym stadium rozwoju samic dojrzałych i niedojrzałych płciowo oraz ciałkach żółtych została przeprowadzona za pomocą metody western blot. Analiza western blot i densytometryczna wykazały, że chemeryna i jej receptory ulegają zmiennej ekspresji w zależności od fazy cyklu. Najwyższy poziom ekspresji chemeryny obserwowano w pęcherzyku dużym i ciałku środkowej fazy lutealnej, natomiast nie wykazano tej samej zależności dla receptorów. Podsumowując, obserwowane zmiany w ekspresji chemeryny i jej receptorów w zależności od fazy cyklu estralnego, wskazują na regulatorowe działanie RARRES2 w przebiegu tego procesu.Chemerin (RARRES2) is a 16 kDa protein which acts as a ligand for three receptors: CMKLR1, CCRL2, GPR1. Chemerin is a new adipokine that is involved in the regulation of adipogenesis, glucose metabolism, and inflammation. Recent studies have shown its expression in ovary, suggesting that it also plays a role in reproductive function. It has been demonstrated that RARRES2 inhibits ovarian steroidogenesis in rat, human and bovine ovary. Therefore, the aim of this study was to investigate the expression of chemerin and its receptors in porcine ovary cells depending on the phase of the estrous cycle. Proteins detections in ovarian follicles at different stages of development of prepubertal and pubertal animals and corpus luteum were performed using the western blot technique. Western blot and densitometric analysis have showed that expression of chemerin and its receptors are changeable depending on the phase of the cycle. The highest level of chemerin was observed in the large follicles and corpus luteum of mid-luteal phase, while the same dependence for the receptors were not demonstrated. In conclusion, the observed changes in the expression of chemerin and its receptors depending on the phase of the estrous cycle, suggests the regulatory role of RARRES2 in this process

Molecular mechanisms of Duchenne muscular dystrophy and new therapeutic strategies

Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD) to choroba genetyczna sprzężona z chromosomem X, dotykająca w przybliżeniu 1 na 5000 urodzonych chłopców. Jest spowodowana mutacjami w genie DMD kodującym dystrofinę, która odpowiada za stabilność mechaniczną mięśni podczas skurczu. Jej brak prowadzi do postępującego osłabienia mięśni i przedwczesnej śmierci chorych w wyniku niewydolności sercowo-oddechowej. W ostatnich latach opracowano wiele eksperymentalnych terapii, których celem jest przywrócenie funkcjonalnej dystrofiny lub przeciwdziałanie procesom przyczyniającym się do postępu choroby, takim jak zapalenie czy zwłóknienie. Pomimo tego DMD wciąż pozostaje chorobą nieuleczalną, a glikokortykoidy, wykazujące wiele działań niepożądanych, nadal stanowią "złoty standard" leczenia. Aktualne jest zatem opracowywanie innowacyjnych możliwości terapeutycznych, które przynajmniej złagodzą objawy DMD. Wśród nich na uwagę zasługuje celowanie w określone mikroRNA (miR), np. miR-378a, przywrócenie prawidłowej angiogenezy oraz wykorzystanie cytoprotekcyjnych czynników takich jak oksygenaza hemowa-1 (HO-1) czy siarkowodór (H2S). W niniejszej pracy omówiono zarówno patologię choroby jak i wspomniane, nowe możliwości terapeutyczne w DMD.Duchenne muscular dystrophy (DMD) is an X-linked genetic disease affecting approximately 1 in 5,000 born boys. It is caused by mutations in the DMD gene encoding dystrophin, which protects muscle fibers upon contraction. Its absence leads to muscle weakening and premature death mostly due to cardio-respiratory failure. Many experimental therapies have been developed to restore functional dystrophin or counteract processes contributing to disease progression. Nonetheless, DMD remains an incurable disease, and glucocorticoids, exerting many side effects, still serve as the "gold standard" of treatment. Hence, there is a need to develop innovative therapeutic options that will at least alleviate the symptoms of DMD. Among them, targeting specific microRNAs (miRs), e.g. miR-378a, restoring normal angiogenesis and the use of cytoprotective factors such as heme oxygenase-1 (HO-1) or hydrogen sulfide (H2S) might be of special interest. In this review, we describe both the pathology of the disease and the aforementioned new therapeutic options in DMD.

Proteome Profiling of the Dystrophic <i>mdx</i> Mice Diaphragm

Mdx mice with a spontaneous mutation in exon 23 of the Dmd gene represent the most common model to investigate the pathophysiology of Duchenne muscular dystrophy (DMD). The disease, caused by the lack of functional dystrophin, is characterized by irreversible impairment of muscle functions, with the diaphragm affected earlier and more severely than other skeletal muscles. We applied a label-free (LF) method and the more thorough tandem mass tag (TMT)-based method to analyze differentially expressed proteins in the diaphragm of 6-week-old mdx mice. The comparison of both methods revealed 88 commonly changed proteins. A more in-depth analysis of the TMT-based method showed 953 significantly changed proteins, with 867 increased and 86 decreased in dystrophic animals (q-value 2S), suggesting that alterations in the metabolism of this gaseous mediator could modulate DMD progression, which could be a potential target for pharmacological intervention