Novel targeted inhibitors for JAK1 and JAK3 tyrosine kinases

Janus kinases (JAKs) are a family of tyrosine kinases that are important in inflammation. Janus kinase inhibitors are used to treat autoimmune and inflammatory diseases like rheumatoid arthritis and inflammatory bowel disease. JAK activity is mediated by the tyrosine kinase domain (JH1) which is regulated by the pseudokinase domain (JH2). All the clinical JAK inhibitors on the market target the JH1, which is more conserved than JH2. Most of the current clinical JAK inhibitors are not specific to one JAK but instead inhibit the activity of many or all of the JAKs. The aim of this thesis was to find an inhibitor, that inhibits the JAK activity by binding to JH2 domain instead. This way the inhibition could be specific to either JAK1 or JAK3, reducing side-effects by better targeting the cytokine signalling that is inhibited. In this thesis, a group of potential JH2 binders were investigated. Some of them were hits from previous smw screenings, but some were identified through a virtual screen and characterized as part of this thesis. The potential JH2 binders for JAK1 or JAK3 were studied fortheir binding specificity and inhibition. Inhibition was studied by Lance Ultra, which analysed the JH1 kinase activity in the context of JH2 regulation, and by cytokine signalling studies which analysed the inhibition of downstream signalling in cellular context. Three compounds, Omipa, Picti and 4G were identified as potential JAK1 JH2 specific binders, and two compounds, Mito and F165 also showed TYK2 JH2 binding along with JAK1 JH2 binding. The compounds did not show inhibition in kinase activity assay but did show inhibition of downstream signalling of either IL6 or IL4. Due to technical issues in cytokine signalling assay, these results need to be replicated in order to validate the findings. The assay could be improved by optimizing the freezing process of the cells or by using unfrozen cell and by optimizing fluorescence barcoding.Janus kinaasit (JAK) ovat tyrosiinikinaasi perhe jotka ovat tärkeitä tulehduksessa. Janus kinaasien inhibiittoreita käytetään autoimmuuni- ja tulehduksellisten sairauksien kuten nivelreuman ja tulehduksellisten suolistosairauksien hoitoon. JAK aktiivisuutta välittää tyrosiinikinaasi osa (JH1) jota säätelee pseukokinaasidomeeni (JH2). Kaikki markkinoilla olevat kliiniset JAK inhibiittorit sitoutuvat JH1-osaan joka on konservoituneempi kuin JH2i. Useimmatkäytössä olevat kliiniset JAK inhibiittorit eivät ole spesifisiä yhdelle JAK:ille, vaan inhiboivat monien tai kaikkien JAK:ien aktiivisuutta. Tämän opinnäytetyön tavoiteena oli löytää inhibiittori, joka inhiboi JAK aktiivisuutta sitoutumalla JH2 osaan. JH2 välitteinen inhibitio voisi olla spesifistä joko JAK1:lle tai JAK3:lle, vähentäen sivuvaikutuksia kohdentamalla paremmin inhiboitua sytokiinisignalointia. Tässä opinnäytetyössä tutkittiin ryhmää potentiaalisia JH2 sitoutuja. Osa niistä oli löydöksiä aiemmista virtuaaliseulonnoista, mutta osa tunnistettiin virtuaalisessa seulonnassa, joka on sisällytetty tähän opinnäytetyöhön. Potentiaalisista JAK1 tai JAK3 JH2 sitoutujista tutkittiin sitoutumisen spesifisyys ja inhibitio. Inhibition tutkittiin käyttämällä Lance Ultraa, mikä tutkii JH1:n kinaasiaktiivisuutta yhdessä JH2:n säätelyn kanssa. Inhibitiota tutkittiin myös sytokiinisignalointia tutkimalla, mikä tarkastelee solusignaloinnin inhibitiota. Kolme yhdistettä, Omipa, Picti ja 4G tunnistettiin potentiaalisiksi JAK1 JH2 spesifisiksi sitoutujiksi ja kaksi yhdistettyä, Mito ja F165 osoittivat lisäksi myös TYK2 JH2 sitoutumistai. Nämä yhdisteet eivät osoittaneet inhibitiota kinaasiaktiivisuuden tarkastelussa, mutta osoittivat joko IL6:n tai IL4:n alavirran signaloinnin inhibitiota. Johtuen teknisistä ongelmista sytokiinisignalointikokeissa, nämä tulokset tulee toistaa löydösten validoimiseksi. Sytokiinisignalointikoetta voisi kehittää optimoimalla solujen jäädytystä tai käyttämällä tuoreita soluja sekä optimoimalla fluoresenssi barkoodausta

AI is a viable alternative to high throughput screening: a 318-target study

: High throughput screening (HTS) is routinely used to identify bioactive small molecules. This requires physical compounds, which limits coverage of accessible chemical space. Computational approaches combined with vast on-demand chemical libraries can access far greater chemical space, provided that the predictive accuracy is sufficient to identify useful molecules. Through the largest and most diverse virtual HTS campaign reported to date, comprising 318 individual projects, we demonstrate that our AtomNet® convolutional neural network successfully finds novel hits across every major therapeutic area and protein class. We address historical limitations of computational screening by demonstrating success for target proteins without known binders, high-quality X-ray crystal structures, or manual cherry-picking of compounds. We show that the molecules selected by the AtomNet® model are novel drug-like scaffolds rather than minor modifications to known bioactive compounds. Our empirical results suggest that computational methods can substantially replace HTS as the first step of small-molecule drug discovery

Makrofagien ja mikrogliojen immuunisuppressiivinen signalointi glioblastoomassa

Glioblastooma (GBM) on pahalaatuinen keskushermoston graduksen IV kasvain, jossa elinaika diagnoosin jälkeen on noin 15 kuukautta. Glioblastooman immuuniterapiasta ei ole saatu toivotun kaltaisia tuloksia. Siksi tämän työn tavoitteena on tutkia glioblastooman immuunisuppressiota sitä välittävien makrofagien ja mikrogliojen näkökulmasta. Immuunisuppressiossa immuunipuolustusjärjestelmän kyky tunnistaa syöpä ja hyökätä sitä vastaan on heikentynyt. Immuunisuppression kehittymistä voidaan edesauttaa esimerkiksi vaikuttamalla T-solujen toimintaan tai edistämällä makrofagien ja mikrogliojen polarisaatiota kohti immuunisuppressiivista M2-muotoa. Tässä työssä käydään läpi glioblastoomassa tärkeitä solujen väliseen ja sisäiseen signalointiin osallistuvia molekyylejä, eli signalointimolekyylejä. Näihin lukeutuu sekä ligandit, reseptorit, että signaalinvälittäjät. Työssä käydään läpi signalointimolekyylejä, jotka aiheuttavat M2-polarisaatioita sekä signalointimolekyylejä, joiden avulla makrofagit ja mikrogliat edistävät immuunisuppressiota. Glioblastoomassa immuunisupression kannalta merkittäviä säätelijöitä ovat neurofibromiini 1 (NF1), programmed death ligand 1 (PD-L1), the signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3), interleukiini 10 (IL-10) ja nuclear factor -κB (NFκB). Lisäksi glioblastoomissa on merkittävässä roolissa isositraattidehydrogenaasin (IDH) mutaatio. NF1 on tuumorisuppressori, joka voidaan menettää glioblastoomasoluissa. Tämä voi johtaa muiden signalointimolekyylien voimistavaan säätelyyn sekä makrofageissa ja mikroglioissa. Syöpäsolujen IDH-mutaatio tekee kasvaimista immunologisesti vähemmän aktiivisia, mutta PD-L1, IL-10, NFκB ja STAT3 edesauttavat immuunisuppressiota. Näiden signalointimolekyylien yhteisvaikutuksen parempi ymmärtäminen auttaisi kehittämään parempia terapeuttisia sovelluksia glioblastooman hoitoon