Transiente Glukose-Exposition des Nematoden Caenorhabditis elegans: Ein Modell für das metabolische Gedächtnis im Diabetes mellitus

Das metabolische Gedächtnis im Diabetes mellitus ist die biochemische Grundlage der Entwicklung diabetischer mikrovaskulärer Langzeitkomplikationen wie der diabetischen Retinopathie, Nephropathie und Neuropathie. Komplexe irreversible Mechanismen können nach einer initialen Episode schlechter Kontrolle der Blutglukose anhaltende zelluläre Veränderungen verursachen, die durch die bisherigen vorwiegend blutglukosesenkenden Therapien nicht rückführbar sind. Ziel dieser Arbeit war es die anhaltenden Auswirkungen transienter Glukose-Exposition (GE) in dem Modellorganismus C. elegans im Vergleich zu persistenter GE zu untersuchen, Effekte im Sinne eines metabolischen Gedächtnisses zu identifizieren und somit die Eignung als Modell für dieses Phänomen zu evaluieren. Transiente Glukose-Exposition konnte im Vergleich zu persistenter GE keine erhöhte Bildung von „Advanced Glycation Endproducts (AGEs)“, einer typischen Veränderung des metabolischen Gedächtnisses induzieren. Allerdings zeigten sich Hinweise auf weitere Veränderungen wie eine erhöhte Bildung von reaktivem oxidativem Stress (ROS) nach transienter, sowie persistenter GE. Protektive Auswirkungen betrafen eine Erhaltung der Motilität im Alterungsprozess durch transiente und persistente GE, sowie eine Lebensverlängerung, die nur durch transiente GE induziert werden konnte. Diese protektiven Effekte könnten im Sinne der Mitohormese erklärt werden, die eine Induktion antioxidativer Systeme nach Stimulation mit ROS beschreibt. Dieser Mechanismus kann den Organismus vor späteren Schäden übermäßiger ROS-Bildung schützen. Im Gegensatz zu weiteren publizierten Studien zur Auswirkung von GE in C. elegans wurden hier sehr hohe Glukosekonzentrationen gewählt um eine Glukotoxizität zu untersuchen. Neben weiteren methodischen Unterschieden könnte das eine Erklärung für die zum Teil unterschiedlichen Ergebnisse liefern. Auf Transkriptomebene zeigte sich die Genexpression multipler Signal- und Stoffwechselwege anhaltend nach transienter GE verändert. Neben gleichgerichteten Mechanismen nach transienter und persistenter GE zeigten sich auch Mechanismen, die nur nach transienter GE anhaltend verändert waren. Komponenten des Insulinrezeptorsignalwegs zeigten sich vermindert, wohingegen Gene des Aminosäurestoffwechsel vermehrt exprimiert wurden, was insgesamt als Hinweise auf eine Insulinresistenz gedeutet werden könnte. Eine verminderte Genexpression endozytotischer Gene in beiden Gruppen könnte in Verbindung mit einem verringerten Recycling des Insulinrezeptors stehen. Weitere gleichgerichtete Genexpression von Signalwegen nach transienter und persistenter GE betraf antioxidative Enzyme sowie einerseits eine Verminderung ribosomaler RNA-Produktion und Reifung, andererseits eine Erhöhung ribosomaler Proteinproduktion. Diese Veränderungen sprechen für eine gestörte, potentiell inhibierte Translation, worauf auch die verminderte Genexpression der proteinprozessierenden Gene im endoplasmatischen Retikulum in beiden Gruppen hindeutet. Einzig nach transienter GE, aber nicht persistenter GE zeigte sich die Genexpression des FoxO- sowie mTOR-Signalweges vermindert, die unter Kontrolle des Insulinrezeptors stehen und einen Einfluss auf antioxidative sowie mitogene Prozesse wie Zellwachstum und –teilung haben. Diese Ergebnisse sollten mittels Untersuchung der Proteinexpression und mechanistischer Studien validiert werden. Sie liefern Hinweise auf neuartige Mechanismen des metabolischen Gedächtnisses, die eine unterschiedliche Regulation abhängig von der Dauer der GE zeigen. Metabolisch konnte unter persistenter GE keine erhöhte Glukosemenge in den C. elegans gemessen werden. Eine Messung des glykolytischen Flux in weiteren Studien könnte den Metabolismus der Glukose weiter entschlüsseln. Aufgrund der hohen GE-Konzentration wurde mittels Mannitol-exposition (ME) die Rolle der Osmose in diesem Modell untersucht. Die verringerte Größe, Länge und Proteingehalt der Nematoden unter GE konnte in gleichem Ausmaß unter ME erreicht werden. Im Gegensatz dazu war der Einfluss auf Lebensspanne und Motilität nicht vollständig über osmotische Mechanismen zu erklären, was auf weitere glukose-spezifische Mechanismen hindeutet. Insgesamt können durch transiente GE anhaltende AGE-unabhängige Effekte in C. elegans induziert werden, deren Mechanismen nicht vollständig geklärt sind. Das Modell des Fadenwurms kann nach den Daten dieser Studie Hinweise zur Aufklärung von frühen, noch nicht charakterisierten Mechanismen des metabolischen Gedächtnisses geben und damit einen wichtigen Beitrag in der weiteren Erforschung diabetischer Komplikationen und deren potenzieller Behandlung leisten. Zur Durchführung der aufwendigen Versuche konnte im Rahmen dieser Arbeit ein Protokoll für die Massenkultur in C. elegans optimiert werden

Glucosamine protects against neuronal but not vascular damage in experimental diabetic retinopathy

Objective: Glucosamine, an intermetabolite of the hexosamine biosynthesis pathway (HBP), is a widely used nutritional supplement in osteoarthritis patients, a subset of whom also suffer from diabetes. HBP is activated in diabetic retinopathy (DR). The aim of this study is to investigate the yet unclear effects of glucosamine on DR. Methods: In this study, we tested the effect of glucosamine on vascular and neuronal pathology in a mouse model of streptozotocin-induced DR in vivo and on cultured endothelial and Müller cells to elucidate the underlying mechanisms of action in vitro. Results: Glucosamine did not alter the blood glucose or HbA1c levels in the animals, but induced body weight gain in the non-diabetic animals. Interestingly, the impaired neuronal function in diabetic animals could be prevented by glucosamine treatment. Correspondingly, the activation of Müller cells was prevented in the retina as well as in cell culture. Conversely, glucosamine administration in the normal retina damaged the retinal vasculature by increasing pericyte loss and acellular capillary formation, likely by interfering with endothelial survival signals as seen in vitro in cultured endothelial cells. Nevertheless, under diabetic conditions, no further increase in the detrimental effects were observed. Conclusions: In conclusion, the effects of glucosamine supplementation in the retina appear to be a double-edged sword: neuronal protection in the diabetic retina and vascular damage in the normal retina. Thus, glucosamine supplementation in osteoarthritis patients with or without diabetes should be taken with care

Determination of the LOQ in real-time PCR by receiver operating characteristic curve analysis: application to qPCR assays for Fusarium verticillioides and F. proliferatum

Real-time PCR (qPCR) is the principal technique for the quantification of pathogen biomass in host tissue, yet no generic methods exist for the determination of the limit of quantification (LOQ) and the limit of detection (LOD) in qPCR. We suggest using the Youden index in the context of the receiver operating characteristic (ROC) curve analysis for this purpose. The LOQ was defined as the amount of target DNA that maximizes the sum of sensitivity and specificity. The LOD was defined as the lowest amount of target DNA that was amplified with a false-negative rate below a given threshold. We applied this concept to qPCR assays for Fusarium verticillioides and Fusarium proliferatum DNA in maize kernels. Spiked matrix and field samples characterized by melting curve analysis of PCR products were used as the source of true positives and true negatives. On the basis of the analysis of sensitivity and specificity of the assays, we estimated the LOQ values as 0.11 pg of DNA for spiked matrix and 0.62 pg of DNA for field samples for F. verticillioides. The LOQ values for F. proliferatum were 0.03 pg for spiked matrix and 0.24 pg for field samples. The mean LOQ values correspond to approximately eight genomes for F. verticillioides and three genomes for F. proliferatum. We demonstrated that the ROC analysis concept, developed for qualitative diagnostics, can be used for the determination of performance parameters of quantitative PCR

Sex differences in cerebral venous sinus thrombosis after adenoviral vaccination against COVID-19

Introduction: Cerebral venous sinus thrombosis associated with vaccine-induced immune thrombotic thrombocytopenia (CVST-VITT) is a severe disease with high mortality. There are few data on sex differences in CVST-VITT. The aim of our study was to investigate the differences in presentation, treatment, clinical course, complications, and outcome of CVST-VITT between women and men. Patients and methods: We used data from an ongoing international registry on CVST-VITT. VITT was diagnosed according to the Pavord criteria. We compared the characteristics of CVST-VITT in women and men. Results: Of 133 patients with possible, probable, or definite CVST-VITT, 102 (77%) were women. Women were slightly younger [median age 42 (IQR 28–54) vs 45 (28–56)], presented more often with coma (26% vs 10%) and had a lower platelet count at presentation [median (IQR) 50x109/L (28–79) vs 68 (30–125)] than men. The nadir platelet count was lower in women [median (IQR) 34 (19–62) vs 53 (20–92)]. More women received endovascular treatment than men (15% vs 6%). Rates of treatment with intravenous immunoglobulins were similar (63% vs 66%), as were new venous thromboembolic events (14% vs 14%) and major bleeding complications (30% vs 20%). Rates of good functional outcome (modified Rankin Scale 0-2, 42% vs 45%) and in-hospital death (39% vs 41%) did not differ. Discussion and conclusions: Three quarters of CVST-VITT patients in this study were women. Women were more severely affected at presentation, but clinical course and outcome did not differ between women and men. VITT-specific treatments were overall similar, but more women received endovascular treatment.</p