การวิเคราะห์หาปริมาณไบโอจีนิกเอมีนบางชนิดในไส้กรอกพื้นเมืองไทย (QUANTITATIVE OF SOME BIOGENIA AMINE IN THAI TRADITIONAL SAUSAGE)

ไบโอจีนิกเอมีน ได้แก่ ฮีสตามีน พิวเทรสซีน และคาร์ดาเวรีน สามารถพบในอาหารหลายชนิดโดยเฉพาะอย่างยิ่งอาหารที่มีโปรตีนสูง ในงานวิจัยนี้ได้ให้ความสนใจต่อการวิเคราะห์ไส้กรอกพื้นเมืองของไทยที่มีชื่อว่าไส้กรอกอีสาน ไส้อั่ว และหม่ำ ซึ่งไส้กรอกเหล่านี้ทำมาจากเนื้อสัตว์เป็นหลักและผ่านกระบวนการหมักซึ่งเป็นการถนอมอาหารอีกวิธีหนึ่ง การสกัดสารไบโอจีนิกเอมีนทั้ง 3 ชนิดออกจากตัวอย่างไส้กรอกด้วยวิธีทางเคมีคือใช้ตัวทำละลายที่เหมาะสมร่วมกับการสกัดด้วยวิธีทางกายภาพ ได้แก่ การเขย่าด้วยเครื่องโซนิเคเตอร์และการเซ็นตริฟิวจ์ สารไบโอจีนิกเอมีนเกิดจากปฏิกิริยาดีคาร์บอกซิเลชันโดยมีกรดอะมิโนชนิดต่างๆ เป็นสารตั้งต้น งานวิจัยนี้ศึกษาการวิเคราะห์สารไบโอจีนิกเอมีนทั้ง 3 ชนิดในตัวอย่างไส้กรอก โดยนำสารไบโอจีนิก เอมีนทั้งสามมาทำปฏิกิริยากับสารออร์โท-พทาลไดอัลดีไฮด์ในสารละลาย 0.4 M บอเรตบัฟเฟอร์ (pH 9.5) ที่มี 2-เมอร์แคปโตเอทานอลรวมอยู่ด้วยพบว่าสารอนุพันธ์ทั้ง 3 สามารถเกิดปฏิกิริยาอย่างรวดเร็วที่อุณหภูมิห้อง ทำการแยกสารอนุพันธ์ด้วยเทคนิครีเวิร์สเฟสโครมาโทกราฟีของเหลวสมรรถนะสูง ตรวจวัดด้วยฟลูออร์เรสเซ็นต์ที่ λex 335 nm และ λem 460 nm จากการศึกษาสภาวะที่เหมาะสมต่อการแยกสาร ผลการศึกษาพบว่าสภาวะที่เหมาะสม ได้แก่ การใช้วัฏภาคเคลื่อนประกอบด้วย 100 mM  แอซิเตตบัฟเฟอร์ (pH 5.8) : อะซิโตไนไตรต์ในอัตราส่วน 81:19 v/v อัตราการไหล 1.1 ml/min สารอนุพันธ์ดังกล่าวแสดง ตำแหน่งพีคของอนุพันธ์พิวเทรสซีน ฮีสตามีน และคาร์ดาเวรีน ซึ่งมีค่าระยะเวลารีเทนชันเป็น 8.51, 11.33 และ 14.41 นาที ตามลำดับ นอกจากนี้ได้ศึกษาสารละลายตัวกลางคือโซเดียมไฮดรอกไซด์ และเกลือโซเดียมคลอไรด์ พบว่าสารทั้งสองมีผลลดค่าความเข้มของสัญญาณแสงฟลูออเรสเซนต์ เมื่อนำวิธีนี้ไปในการวิเคราะห์ปริมาณฮีสตามีน พิวเทรสซีน และคาร์ดาเวรีนในตัวอย่างไส้กรอกพื้นเมืองไทย พบว่าสามารถตรวจพบสารไบโอจีนิกเอมีนทั้งสามชนิดโดยพบ ฮีสตามีน 2-35 ppm พิวเทรสซีน 10-50 ppm และคาร์ดาเวรีน 2-3 ppmคำสำคัญ: ไบโอจีนิกเอมีน ฮีสตามีน พิวเทรสซีน คาร์ดาเวรีน ออร์โท-พทาลไดอัลดีไฮด์Biogenic amine is a substance that synthesis from decarboxylation reaction of precursors amino acids. Histamine, putrescine and cadaverine are important biogenic amines which were found in many foods especially in food containing rich protein. This research work focused on analysis of those 3 biogenic amines in thai traditional sausages as E-sarn sausage, Mum sausage and Sai-owe Sausage. The three biogenic amines were extracted from sausage samples by borate buffer (pH 9.5) with ultrasonication and centrifugation. Then the biogenic amines were pre-derivetised with O-phthaldialdehyde (OPA) in borate buffer pH 9.5 containing 2-mercaptoethanol and analysed by reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) with fluorescent detection at λem 460 nm. The optimization condition in analysis was also studied. The best mobile system of 100 mM acetate buffer (pH 5.8) : acetonitrite was 81 : 19 v/v with flow rate at 1.1 ml/min giving good separation. The derivertised products of putrescine, histamine and cadaverine were eluted at the retention time 8.51, 11.33 and 14.41 min. respectively. The sodium hydroxide and sodium chloride solutions effect on the fluorescence intensity of derivertised products. Application of this method to analyse 3 biogenic amines in Thai traditional sasuages revealed the present amount of histamine, putrescine and cadaverine at 2-35, 10-50 and 2-3 ppm, respectively.Keywords: Biogenic amine, Histamine, Putrescine, Cadaverine, O-phthaldialdehyd

การพัฒนาวิธีการวิเคราะห์ปริมาณมาลอนไดอัลดีไฮด์ และ 5-ไฮดรอกซีเมทิล-2-เฟอร์ฟิวรัลดีไฮด์พร้อมกันด้วยเทคนิคโครมาโทกราฟีของเหลวสมรรถนะสูง

งานวิจัยนี้เป็นการศึกษาการวิเคราะห์ปริมาณสารก่อมะเร็ง 2 ชนิด คือ สารประกอบมาลอนไดอัลดีไฮด์ (MDA) และ 5-ไฮดรอกซีเมทิล-2-เฟอร์ฟิวรัลดีไฮด์ (HMF) พร้อมกัน  โดยในงานวิจัยนี้จะอาศัยการทำอนุพันธ์ระหว่าง MDA และ HMF กับ สารละลายกรดไทโอบาร์บิทูริก (TBA) แล้วจึงวิเคราะห์ด้วยเทคนิคโครมาโทกราฟีของเหลวสมรรถนะสูงโดยใช้ระบบรีเวิร์สเฟสโครมาโทกราฟี ซึ่งได้ทำการศึกษาสภาวะต่างๆ ในการแยก ได้แก่ องค์ประกอบของวัฎภาคเคลื่อนที่ อัตราการไหลของวัฎภาคเคลื่อนที่ pH ในการแยก อุณหภูมิและระยะเวลาในการเตรียมอนุพันธ์ และความเข้มข้นของ TBA ที่ใช้ในการเตรียมอนุพันธ์ ทั้งนี้ได้ตรวจวัดสารทั้งสองโดยไดโอดแอเรย์ที่ความยาว 530 nm และ 448 nm ตามลำดับ พบว่าสภาวะที่เหมาะสม ได้แก่ องค์ประกอบของวัฎภาคเคลื่อนที่ที่เป็นเมทานอลต่อฟอสเฟตบัพเฟอร์ที่ 40:60 (v/v) อัตราการไหลของวัฎภาคเคลื่อนที่อยู่ที่ 1.0 mL/min และ pH ของฟอสเฟตบัพเฟอร์ที่ 6.5 โดยใช้ 40 mM TBA ในการเตรียมอนุพันธ์ที่อุณหภูมิ 25°C เป็นเวลา 150 นาที ซึ่งสภาวะดังกล่าวสามารถตรวจวิเคราะห์ HMF และ MDA ได้ที่เวลา 2.6 และ 3.4 นาที ตามลำดับ นอกจากนี้ยังได้ศึกษาความเหมาะสมของวิธีการวิเคราะห์สารทั้งสองในตัวอย่างนม โดยการหาค่าขีดจำกัดต่ำสุดในการตรวจวัด (LOD) ขีดจำกัดต่ำสุดในที่สามารถวิเคราะห์ปริมาณได้ (LOQ) และร้อยละการคืนกลับ ซึ่งวิธีการที่พัฒนาขึ้นมีค่าของ LOD ของ MDA และ HMF อยู่ที่ (S/N = 3) 0.01 nmol/ml และ 0.30 nmol/mL ตามลำดับ ค่า LOQ ของ MDA และ HMF อยู่ที่ (S/N = 10) 0.07 nmol/mL และ 2.38 nmol/mL ตามลำดับ ในการวิเคราะห์ MDA และ HMF ในตัวอย่างนมพร้อมดื่ม พบว่า ค่าเฉลี่ยของร้อยล่ะการคืนกลับของวิธีการซึ่งทดสอบมีค่า 75.71% และ 107.51% ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน (%RDS) เฉลี่ยอยู่ที่ 8.5% และ 6.2% ตามลำดับ ซึ่งข้อมูลที่ได้จากงานวิจัยนี้ยังสามารถนำไปประยุกต์ใช้สำหรับวิเคราะห์ปริมาณ MDA และ HMF พร้อมกันได้ในตัวอย่างผลิตภัณฑ์อื่นๆ ต่อไปคำสำคัญ: มาลอนไดอัลดีไฮด์ 5-ไฮดรอกซีเมทิล-2-เฟอร์ฟิวรัลดีไฮด์ กรดไทโอบาร์บิทูริกThe optimal conditions for simultaneous analysis of malondialdehyde and hydroxymethylfurfuraldehyde contents were investigated. Both substance are claimed to be carcinogenic substances in several foods. In this research, the derivertized substances of malondialdehyde and hydroxymethylfurfuraldehyde were prepared with 2-thiobarbituric acid. Then those derivertized substances were separated and analyzed theirs content by reverse phase high performance chromatographic technique. The optimized parameters such as mole ratio of mobile phase, flow rate, pH, temperature, time and reagent concentration were studied and detected both substance by diode array detector at 530 and 448 nm, respectively. The optimum condition showed that  the ratio between methanol and phosphate buffer (pH 6.5) was 40 : 60 (v/v). The flow rate was controlled at 1.0 ml/min. The derivertized substances were prepared  by 40 mM thiobarbituric acid as the reagent to react with both substances at 25°C for 150 min. Both derivatived substances showed different color, so derivative compounds were separated and identified at retention time 2.6 and 3.4 min,respectively. The result of validate method for analysis both substances in milk sample including LOD and LOQ showed that LOD (S/N = 3) and LOQ (S/N = 10) of MDA ware 0.01 nmol/ml and 0.07 nmol/ml, respectively. The LOD in HMF analysis was 0.30 nmol/ml and LOQ was 2.38 nmol/ml. The recoveries (%) of MDA and HMF were 75.7% and 107.5%, respectively. The relative standard deviation (%RSD) of both compounds were 8.5 and 6.2%, respectively. These methods were successfully developed for the determination of HMF and MDA in drinking milk samples and can be applied for detection in several samples.Keywords: malondialdehyde, hydroxymethylfurfuraldehyde, Thiobarbituric aci