Opracowanie metody SPME/LC-MS do izolacji leków psychotropowych z materiału biologicznego pobranego pośmiertnie

Metoda mikroekstrakcji do fazy stałej w połączeniu z chromatografią cieczową sprzężoną ze spektrometrią mas (SPME/LC-MS) jest wykorzystywana w analizach toksykologicznych, w tym do oznaczania leków psychotropowych w próbkach materiału biologicznego. Celem pracy była optymalizacja metody SPME/LC-MS pod kątem wykorzystanie jej w oznaczaniu leków psychotropowych z grupy benzodiazepin, selektywnych inhibitorów wychwytu zwrotnego serotoniny, selektywnych inhibitorów wychwytu zwrotnego serotoniny i noradrenaliny, trójpierścieniowych leków przeciwdepresyjnych oraz leków nasennych „Z” w próbkach krwi i aspiratu szpiku kostnego pobranych pośmiertnie. Procesowi optymalizacji poddano objętość próbki, czas ekstrakcji, proces oczyszczania poekstrakcyjnego oraz czas desorpcji. Wyznaczono parametry walidacyjne takie jak: granica wykrywalności i oznaczalności, liniowość, precyzja w ciągu dnia i między dniami oraz efekt matrycy. Otrzymane wartości mieszczą się w dopuszczalnym zakresie dla analiz toksykologicznych. Przydatność opracowanej metody potwierdzono analizując 8 próbek aspiratu szpiku kostnego pobranego pośmiertnie. Stężenia leków wyznaczono w próbkach rzeczywistych z dużą precyzją, co daje w przyszłości perspektywy jej rutynowego zastosowania do analiz toksykologiczno-sądowych.The solid phase microextraction method in combination with liquid chromatography coupled with mass spectrometry (SPME/LC-MS) is used in toxicological analyses, including the determination of psychotropic drugs in biological material samples. The aim of the study was to optimize the SPME/LC-MS method for the determination of psychotropic drugs: benzodiazepines, selective serotonin reuptake inhibitors, selective serotonin and noradrenaline reuptake inhibitors, tricyclic antidepressants and sleeping pills "Z" in post-mortem blood samples and post-mortem aspirates of bone marrow. The volume of the sample, adsorption time, post-adsorption purification and desorption time were optimized. Determined validation parameters were: limit of detection and quantification, linearity, precision during and between days and the matrix effect. The values obtained are within the acceptable range for toxicological analyses. The usefulness of the method was confirmed by analyzing 8 samples of bone marrow aspirate taken posthumously. Drug concentrations were determined in real samples with high precision, which gives perspectives for its routine application in toxicological and forensic analyses in the future

Zastosowanie metody suchej kropli krwi (DBS) w analizie toksykologicznej

Toksykologia to nauka zajmująca się wieloma zagadnieniami, w tym i identyfikacją oraz oznaczaniem składników w określonym materiale biologicznym. Mogą nim być tak krew czy mocz, ale także tkanki, włosy, a nawet paznokcie, przy czym to krew jest najczęściej wykorzystywana do badań toksykologicznych na obecność leków psychotropowych. Dla poszczególnych rodzajów próbek materiału biologicznego stonowane są inne metody ich przygotowania. Jedną z alternatywnych metod przygotowywania próbek krwi do oznaczania leków psychotropowych jest metoda suchej kropli krwi (DBS). Zgodnie z nią mała objętość badanej próbki krwi nanoszona jest na specjalną kartę DBS, a następnie karta ta pozostawiana jest do wyschnięcie, by ostatecznie poddać ją ekstrakcji w celu wyodrębnienia badanych analitów. Oznaczanie leków psychotropowych we krwi, w tym benzodiazepin najczęściej znajduje zastosowanie w chemii sądowej. Celem przedmiotowej pracy było opracowanie metody przygotowania próbki krwi z wykorzystaniem techniki DBS do oznaczania alprazolamu i diazepamu, przy czym do badań wykorzystywano także krew wolną od oznaczanych analitów, jak i krew sekcyjną. W trakcie badań krew nanoszona była na specjalną kartę FTA DMPK C, a z której po wysuszeniu wycinano 3-mm dyski za pomocą specjalnego narzędzia - punchera. Ekstrakcję wspomaganą ultradźwiękami przeprowadzono przy użyciu mieszaniny metanol/acetonitryl (1:1, v/v), natomiast supernatant filtrowany był przy użyciu filtrów PTFE o średnicy porów równej 45 µm, po czym odparowany pod azotem w temperaturze 40℃. Przygotowane próbki analizowane były przy użyciu aparatury LC-MS, gdzie fazę ruchomą stanowił 0,1% kwas mrówkowy oraz acetonitryl. W ramach przeprowadzonych badań opracowana została procedura ilościowego oznaczenia diazepamu oraz alprazolamu przy użyciu metody DBS. W celu potwierdzenia jej poprawności oraz rzetelności przeprowadzono walidację, w ramach której określono takie parametry walidacyjne jak: zakres liniowości (R2 > 0.999 dla alprazolamu, R2 > 0.993 dla diazepamu w zakresie stężeń 4,3 — 38,3 ng/mL), granicę wykrywalności (LOD: 1,08 ng/mL dla alprazolamu, 0,61 ng/mL dla diazepamu), granicę oznaczalności (LOQ: 3,59 ng/mL dla alprazolamu, 2,03 ng/mL dla diazepamu), precyzję na trzech poziomach stężeń w ciągu jednego dnia (współczynnik zmienności CV%: 4.73 — 14.22% dla alprazolamu, 3.13 — 7.16% dla diazepamu) i pomiędzy dniami (współczynnik zmienności CV%: 5.04 — 17.37% dla alprazolamu, 3.58 — 19.99% dla diazepamu) oraz odzysk (90.63 — 108.5% dla alprazolamu, 94.89 — 103.44% dla diazepamu). Stężenie diazepamu we krwi sekcyjnej wyniosło 53,0 ng/mL (błąd względny wyniósł ±5.7%). Otrzymane wartości parametrów walidacyjnych są satysfakcjonujące dla tej metody, co umożliwia jej wykorzystanie do badań ilościowych na zawartość alprazolamu oraz diazepamu we krwi. Podkreślenia wymaga, iż wykorzystana do analizy ilościowej metoda sprzężona z chromatografią cieczową i spektrometrem mas wymaga niewielkich objętości próbek (mniej niż 50µL), a co istotne jest stosunkowo krótka i prosta oraz pozwala na jej wykorzystanie zarówno w chemii sądowej jak i szeroko rozumianej toksykologii.[1] Analytical toxicology Hans H.; Molecular, Clinical, and Environmental Toxicology Andreas Luch, 2010, Volume 2: Clinical Toxicology, 317–337;[2] Analysis of benzodiazepines and their metabolites using DBS cards and LC-MS/MS Heesang Lee, Yujin Park, Jiyeong Jo, Sangwhan In, Yonghoon Park, Eunmi Kim, Jaesung Pyo, Sanggil Choe, 2015;Analytical toxicology deals with various problems like screening, confirmation, identification and quantification of foreign compounds in different biological matrices. These matrices are blood, urine, and tissues, or alternative matrices like hair or nails. Blood is the sample of choice for quantification analysis of xenobiotics because the analyte concentration in blood correlates best with its biological effects [1]. For the samples, various methods of preparation are used. One of them is the Dried Blood Spot (DBS) method which is a form of bio-sampling where small amounts of blood are blotted on the special cards, dried and then extraction takes place. Screening drugs like benzodiazepines in blood are often used in forensic chemistry [2]. For analysis, blood without subjected substances and the postmortem blood were used. Blood was spotted on the FTA DMPK C cards, then dried and 3-mm discs were punched. Extraction was carried out with a mixture of methanol/acetonitrile (1:1, v/v) and aided by ultra-sonification bath. After extraction, the supernatant was filtered through PTFE filter with pores size 0.45 µm and then solutions were evaporated under nitrogen in 40℃. The samples were analyzed using LC-MS, where the mobile phase was 0.1% formic acid and acetonitrile. The methodology for quantitive analysis of diazepam and alprazolam using the DBS method was carried out. To confirm the reliability of used DBS method the validation took place. Validation parameters are: linearity (R2 > 0.999 for alprazolam, R2 > 0.993 for diazepam in range of 4.3 — 38.3 ng/mL), limit of detection (LOD: 1.08 ng/mL for alprazolam, 0.61 ng/mL for diazepam), limit of quantification (LOQ: 3.59 ng/mL for alprazolam, 2.03 ng/mL for diazepam), precision for three levels of concentrations during one day (the coefficient of variation CV%: 4.73 — 14.22% for alprazolam, 3.13 — 7.16% for diazepam) and among days (the coefficient of variation CV%: 5.04 — 17.37% for alprazolam, 3.58 — 19.99% for diazepam) and recovery (90.63 — 108.5% for alprazolam, 94.89 — 103.44% for diazepam). Diazepam concentration in postmortem blood was 53.0 ng/mL (bias, relative error RE%: ±5.7%). Validation parameters for this method are satisfying. Used DBS method coupled with LC/MS for quantitative analysis of alprazolam and diazepam in blood needs small volumes of samples (less than 50µL), is short, and simple, so may be perfectly used in forensic chemistry and toxicology.[1] Analytical toxicology Hans H.; Molecular, Clinical, and Environmental Toxicology Andreas Luch, 2010, Volume 2: Clinical Toxicology, 317–337;[2] Analysis of benzodiazepines and their metabolites using DBS cards and LC-MS/MS Heesang Lee, Yujin Park, Jiyeong Jo, Sangwhan In, Yonghoon Park, Eunmi Kim, Jaesung Pyo, Sanggil Choe, 2015

Determinants of the level of circulating-tumor HPV16 DNA in patients with HPV-associated oropharyngeal cancer at the time of diagnosis

Abstract Circulating tumor HPV DNA (ctHPV16) assessed in liquid biopsy may be used as a marker of cancer in patients with HPV-associated oropharyngeal cancer (HPV + OPC). Factors influencing the initial ctHPV16 quantity are not well recognized. In this study we aimed to establish what factors are related to the level of ctHPV16 at the time of diagnosis. 51 patients (37 men and 14 women, median age of 57 years old) with HPV + OPC prior to definitive treatment were included. ctHPV16 was measured by qPCR. Tumor and nodal staging were assessed according to AJCC8. Blood derived factors included squamous cell carcinoma antigen (SCC-Ag), serum soluble fragment of cytokeratin 19 (CYFRA 21-1), C-reactive protein (CRP), albumin level (Alb), neutrophils (Neut), thrombocytes (Plt) and lymphocyte (Lym) count, Neut/Lym ratio were assessed. The volumes of the primary tumor (TV) and involved lymph nodes (NV) were calculated using MRI, CT or PET-CT scans. Data were analysed using parametric and nonparametric methods. Variables for multivariable linear regression analysis were chosen based on the results from univariable analysis (correlation, univariable regression and difference). There were 9 (18%), 10 (19%) and 32 (63%) patients who had TV and NV assessed in MRI, CT or PET respectively. Primary tumor neither as T-stage nor TV was related to ctHPV16 level. Significant differences in the ctHPV16 between patients with high vs low pain (P = 0.038), NV (P = 0.023), TV + NV (P = 0.018), CYFRA 21-1 (P = 0.002), CRP (P = 0.019), and N1 vs N3 (P = 0.044) were observed. ctHPV16 was significantly associated with CYFRA 21-1 (P = 0.017), N stage (P = 0.005), NV (P = 0.009), TV + NV (P = 0.002), CRP (P = 0.019), and pain (P = 0.038). In univariable linear regression analysis the same variables predicted ctHPV16 level. In multivariable analyses, CYFRA 21-1 and CRP (both as categorical variables) were predictors of ctHPV16 level even above NV. ctHPV16 at presentation is driven by tumor volume measured mostly by N. CYFRA 21-1 and CRP are additional factors related to ctHPV16 prior to the treatment