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Analysis of Endocytic Pathways in Drosophila Cells Reveals a Conserved Role for GBF1 in Internalization via GEECs
In mammalian cells, endocytosis of the fluid phase and glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins (GPI-APs) forms GEECs (GPI-AP enriched early endosomal compartments) via an Arf1- and Cdc42-mediated, dynamin independent mechanism. Here we use four different fluorescently labeled probes and several markers in combination with quantitative kinetic assays, RNA interference and high resolution imaging to delineate major endocytic routes in Drosophila cultured cells. We find that the hallmarks of the pinocytic GEEC pathway are conserved in Drosophila and identify garz, the fly ortholog of the GTP exchange factor GBF1, as a novel component of this pathway. Live confocal and TIRF imaging reveals that a fraction of GBF1 GFP dynamically associates with ABD RFP (a sensor for activated Arf1 present on nascent pinosomes). Correspondingly, a GTP exchange mutant of GBF1 has altered ABD RFP localization in the evanescent field and is impaired in fluid phase uptake. Furthermore, GBF1 activation is required for the GEEC pathway even in the presence of Brefeldin A, implying that, like Arf1, it has a role in endocytosis that is separable from its role in secretion
β-Catenin asymmetry is regulated by PLA1 and retrograde traffic in C. elegans stem cell divisions
Asymmetric division is an important property of stem cells. In Caenorhabditis elegans, the Wnt/β-catenin asymmetry pathway determines the polarity of most asymmetric divisions. The Wnt signalling components such as β-catenin localize asymmetrically to the cortex of mother cells to produce two distinct daughter cells. However, the molecular mechanism to polarize them remains to be elucidated. Here, we demonstrate that intracellular phospholipase A1 (PLA1), a poorly characterized lipid-metabolizing enzyme, controls the subcellular localizations of β-catenin in the terminal asymmetric divisions of epithelial stem cells (seam cells). In mutants of ipla-1, a single C. elegans PLA1 gene, cortical β-catenin is delocalized and the asymmetry of cell-fate specification is disrupted in the asymmetric divisions. ipla-1 mutant phenotypes are rescued by expression of ipla-1 in seam cells in a catalytic activity-dependent manner. Furthermore, our genetic screen utilizing ipla-1 mutants reveals that reduction of endosome-to-Golgi retrograde transport in seam cells restores normal subcellular localization of β-catenin to ipla-1 mutants. We propose that membrane trafficking regulated by ipla-1 provides a mechanism to control the cortical asymmetry of β-catenin
Crystallographic Snapshots of Tyrosine Phenol-lyase Show That Substrate Strain Plays a Role in C–C Bond Cleavage
In-Cell RNA Hydrolysis Assay: A Method for the Determination of the RNase Activity of Potential RNases
Improvement and efficient display of Bacillus thuringiensis toxins on M13 phages and ribosomes
Specific GFP-binding artificial proteins (αRep): a new tool for in vitro to live cell applications
Développement de vecteurs innovants pour le ciblage d'antigènes cancéreux
Actuellement, les anticorps sont largement utilisés en thérapie pour le ciblage de cellules tumorales car ils présentent une haute affinité et spécificité pour leur cible. Cependant, ils présentent des limites pour une utilisation en imagerie, principalement liées à leur grande taille qui entraîne une biodistribution et une élimination lentes de l organisme. Ces inconvénients amènent au développement de vecteurs alternatifs aux anticorps. Ces dernières années, l équipe d accueil a utilisé une stratégie originale pour développer la nouvelle classe de protéines affines artificielles, les Affitins. Ce sont des variants de Sac7d, issue de l archée Sulfolobus acidocaldarius qui a pour rôle physiologique de fixer l ADN double brin. Elle présente de nombreuses propriétés attractives pour une alternative aux anticorps : 20 fois plus petite qu un anticorps conventionnel, soluble, thermiquement très stable et résiste aux pH extrêmes. Différentes cibles ont déjà été atteintes (protéines bactériennes, humaines et animales, bactéries vivantes) montrant qu il est possible d isoler des variants de Sac7d stables, solubles, avec un taux de production élevé chez Escherichia coli et capables de se lier de manière spécifique à leur cible avec des affinités de l ordre du nanomolaire. Des premiers résultats in vivo montrent une biodistribution et une clairance rapide adaptée à une utilisation en imagerie. Le but de ma thèse était dans un premier temps de sélectionner des Affitins contre HER-1 et HER-2, récepteurs surexprimés à la surface de nombreuses cellules cancéreuses, marqueurs de mauvais pronostic car ils engendrent notamment une stimulation de la croissance du cancer et une inhibition de l apoptose. Dans un deuxième temps, mon travail a consisté à mettre au point un système qui permettra de cribler les Affitins sélectionnées directement sur des cellules exprimant HER1 et HER2.TOURS-BU Sciences Pharmacie (372612104) / SudocSudocFranceF
Identification of Functionally Important Residues in the Pyridoxal-5‘-Phosphate-Dependent Catalytic Antibody 15A9
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