Using Glucan Water Dikinase for in vitro glucan phosphorylation

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Ingénierie rationnelle de la dextrane-saccharase DSR-S : compréhension du mécanisme de\ud polymérisation pour la synthèse de dextranes de taille contrôlée

La dextrane-saccharase DSR-S de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F catalyse à partir de\ud saccharose la synthèse d’un polymère d’unités glucosyle appelé dextrane, dont plus de 95% des\ud liaisons sont de type alpha-1,6. Ce polysaccharide trouve diverses applications, essentiellement\ud dans la formulation de composés pharmaceutiques, mais aussi comme support de\ud chromatographie et depuis peu comme agent texturant. L’objectif de cette thèse était\ud d’approfondir l’étude des relations structure-fonction de cette dextrane-saccharase, afin de\ud construire par ingénierie rationnelle des catalyseurs produisant des dextranes de taille, de structure\ud et donc de propriétés physico-chimiques contrôlées. L’expression hétérologue du gène dsrS dans\ud E. coli a été améliorée d’un facteur 30. Une forme tronquée a été construite de manière à pouvoir\ud purifier le catalyseur à homogénéité et disposer, pour la première fois, d’une préparation pure de\ud dextrane-saccharase spécifique des liaisons alpha-1,6. Un suivi cinétique de la synthèse de\ud dextrane nous a permis de mettre en évidence la formation de produits de taille intermédiaire au\ud cours de la réaction, dont la concentration et la taille augmentent au cours du temps. Un\ud mécanisme de polymérisation de type « semi-processif » n’impliquant qu’un seul site actif pour\ud l’élongation des dextranes peut donc être aujourd’hui proposé, mettant fin à une trentaine\ud d’années de polémiques. Enfin, l’identification de déterminants structuraux impliqués dans ce\ud mécanisme nous a permis de construire des formes tronquées synthétisant en une seule étape et\ud avec des rendements très avantageux (de 69 à 75 %) les dextranes de 10 000 et 40 000 Da les plus\ud utilisés à l’heure actuelle. Le motif minimal de DSR-S responsable de l’affinité pour le dextrane a\ud également été identifié, et la potentialité d’utiliser ce peptide comme étiquette d’affinité pour des\ud purifications sur gel Sephadex® évaluée. ________________________________________________________________________ Dextransucrase (DSR-S) from Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F catalyses from sucrose the synthesis of a polymer of D-glucosyl units called dextran, in which more than 95 % of the glucosyl units are a-1,6 linked. This polysaccharide has diverse applications, essentially for pharmaceutical compound formulations, but also as chromatographic support and more recently as texturing agent. The objective of the study was to improve our knowledge on the DSR-S structure-function relationships, in order to design new enzymes producing dextrans of controlled size, structure and physico-chemical properties. Heterologous expression of the dsrS gene by E. coli was optimised and the design of a truncated form allowed for the first time the high level purification of a dextransucrase specific for the a-1,6 linkage synthesis. A detailed characterization of the first steps of the polymer formation highlighted the formation of products of intermediate size during the reaction, for which the concentration and average molecular weight increase versus time. A “semi-processive” mechanism of polymerization, involving only one catalytic site for the chain elongation by their non-reducing extremity can thus be proposed. Finally, the identification of structural determinants involved in this process allowed the construction of truncated forms which synthesize, in only one step and with advantageous yields (69 to 75 %), the 10,000 and 40,000 Da dextrans the most widely used toda

Ingénierie rationnelle de la dextrane-saccharase DSR-S (compréhension du mécanisme de polymérisation pour la synthèse de dextranes de taille contrôlée)

La dextrane-saccharase DSR-S de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F catalyse à partir de saccharose la synthèse d un polymère d unités glucosyle appelé dextrane, dont plus de 95% des liaisons sont de type alpha-1,6. Ce polysaccharide trouve diverses applications, essentiellement dans la formulation de composés pharmaceutiques, mais aussi comme support de chromatographie et depuis peu comme agent texturant. L objectif de cette thèse était d approfondir l étude des relations structure-fonction de cette dextrane-saccharase, afin de construire par ingénierie rationnelle des catalyseurs produisant des dextranes de taille, de structure et donc de propriétés physico-chimiques contrôlées. L expression hétérologue du gène dsrS dans E. coli a été améliorée d un facteur 30. Une forme tronquée a été construite de manière à pouvoir purifier le catalyseur à homogénéité et disposer, pour la première fois, d une préparation pure de dextrane-saccharase spécifique des liaisons alpha-1,6. Un suivi cinétique de la synthèse de dextrane nous a permis de mettre en évidence la formation de produits de taille intermédiaire au cours de la réaction, dont la concentration et la taille augmentent au cours du temps. Un mécanisme de polymérisation de type semi-processif n impliquant qu un seul site actif pour l élongation des dextranes peut donc être aujourd hui proposé, mettant fin à une trentaine d années de polémiques. Enfin, l identification de déterminants structuraux impliqués dans ce mécanisme nous a permis de construire des formes tronquées synthétisant en une seule étape et avec des rendements très avantageux (de 69 à 75 %) les dextranes de 10 000 et 40 000 Da les plus utilisés à l heure actuelle. Le motif minimal de DSR-S responsable de l affinité pour le dextrane a également été identifié, et la potentialité d utiliser ce peptide comme étiquette d affinité pour des purifications sur gel Sephadex® évaluéeDextransucrase (DSR-S) from Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F catalyses from sucrose the synthesis of a polymer of D-glucosyl units called dextran, in which more than 95 % of the glucosyl units are a-1,6 linked. This polysaccharide has diverse applications, essentially for pharmaceutical compound formulations, but also as chromatographic support and more recently as texturing agent. The objective of the study was to improve our knowledge on the DSR-S structure-function relationships, in order to design new enzymes producing dextrans of controlled size, structure and physico-chemical properties. Heterologous expression of the dsrS gene by E. coli was optimised and the design of a truncated form allowed for the first time the high level purification of a dextransucrase specific for the a-1,6 linkage synthesis. A detailed characterization of the first steps of the polymer formation highlighted the formation of products of intermediate size during the reaction, for which the concentration and average molecular weight increase versus time. A semi-processive mechanism of polymerization, involving only one catalytic site for the chain elongation by their non-reducing extremity can thus be proposed. Finally, the identification of structural determinants involved in this process allowed the construction of truncated forms which synthesize, in only one step and with advantageous yields (69 to 75 %), the 10,000 and 40,000 Da dextrans the most widely used todayTOULOUSE-INSA (315552106) / SudocSudocFranceF

La sédation consciente par inhalation de protoxyde d'azote en odontologie pédiatrique

MONTPELLIER-BU Médecine UPM (341722108) / SudocMONTPELLIER-BU Odontologie (341722110) / SudocPARIS-BIUM (751062103) / SudocMONTPELLIER-BU Médecine (341722104) / SudocSudocFranceF

Contribution à l'étude de diterpènes de Croton eluteria Bennett (euphorbiaceae)

Ce Travail est consacré à l'étude des diterpénoïdes de Croton eluteria Bennett, un arbre originaire des îles Bahamas. La drogue qu'il fournit, plus connue sous le nom d'écorce de cascarille, est réputée être, en médecine traditionnelle, hypotensive. L'extraction et la purification des extraits acétonique et méthanolique ont abouti à l'isolement de neuf diterpènes. L'identification des molécules a été rendue possible grâce aux techniques spectrales actuelles telles que les spectrométries de masse et de RMN monobidimensitionnelle, homo- et hétéronucléaire. l'un des terpénoïdes est de type phytane, précédemment isolé de Croton linearis L. et décrit pour la première fois dans Croton eluteria Bennett; les huit autres, présentant un squelette néoclérodane furanique, sont des produits naturels nouveaux. Ces derniers diffèrent les uns des autres, par les fonctions et les cyclisations formées entre la décaline et l'hétérocycle furanique et par la nature des substituants en C-3, C-4, C-6 et C-7. Cette étude phytochimique vient confirmer la capacité que recèle la cascarille à synthétiser, à partir d'un noyau commun, de nombreux diterpènes polyfonctionalisés. De plus, des essais biologiques préliminaires effectués sur des anneaux aortiques isolés de rats, ont mis en évidence, pour deux de ces molécules, un effet vaso-relaxant. Ces résultats viennent justifier l'utilisation de la cascarille, en médecine traditionnelle, pour ses propriétés hypotensives.TOULOUSE-ENSAT-Documentation (315552324) / SudocSudocFranceF

GH13 amylosucrases and GH70 branching sucrases, atypical enzymes in their respective families

Amylosucrases and branching sucrases are alpha-retaining transglucosylases found in the glycoside-hydrolase families 13 and 70, respectively, of the clan GH-H. These enzymes display unique activities in their respective families. Using sucrose as substrate and without mediation of nucleotide-activated sugars, amylosucrase catalyzes the formation of an alpha-(1 -> 4) linked glucan that resembles amylose. In contrast, the recently discovered branching sucrases are unable to catalyze polymerization of glucosyl units as they are rather specific for dextran branching through alpha-(1 -> 2) or alpha-(1 -> 3) branching linkages depending on the enzyme regiospecificity. In addition, GH13 amylosucrases and GH70 branching sucrases are naturally promiscuous and can glucosylate different types of acceptor molecules including sugars, polyols, or flavonoids. Amylosucrases have been the most investigated glucansucrases, in particular to control product profiles or to successfully develop tailored alpha-transglucosylases able to glucosylate various molecules of interest, for example, chemically protected carbohydrates that are planned to enter in chemoenzymatic pathways. The structural traits of these atypical enzymes will be described and compared, and an overview of the potential of natural or engineered enzymes for glycodiversification and chemoenzymatic synthesis will be highlighted

Harnessing glycoenzyme engineering for synthesis of bioactive oligosaccharides

International audienceCombined with chemical synthesis, the use of glycoenzyme biocatalysts has shown great synthetic potential over recent decades owing to their remarkable versatility in terms of substrates and regio- and stereoselectivity that allow structurally controlled synthesis of carbohydrates and glycoconjugates. Nonetheless, the lack of appropriate enzymatic tools with requisite properties in the natural diversity has hampered extensive exploration of enzyme-based synthetic routes to access relevant bioactive oligosaccharides, such as cell-surface glycans or prebiotics. With the remarkable progress in enzyme engineering, it has become possible to improve catalytic efficiency and physico-chemical properties of enzymes but also considerably extend the repertoire of accessible catalytic reactions and tailor novel substrate specificities. In this review, we intend to give a brief overview of the advantageous use of engineered glycoenzymes, sometimes in combination with chemical steps, for the synthesis of natural bioactive oligosaccharides or their precursors. The focus will be on examples resulting from the three main classes of glycoenzymes specialized in carbohydrate synthesis: glycosyltransferases, glycoside hydrolases and glycoside phosphorylases

Bacterial α-Glucan and Branching Sucrases from GH70 Family: Discovery, Structure–Function Relationship Studies and Engineering

International audienceGlucansucrases and branching sucrases are classified in the family 70 of glycoside hydrolases. They are produced by lactic acid bacteria occupying very diverse ecological niches (soil, buccal cavity, sourdough, intestine, dairy products, etc.). Usually secreted by their producer organisms, they are involved in the synthesis of α-glucans from sucrose substrate. They contribute to cell protection while promoting adhesion and colonization of different biotopes. Dextran, an α-1,6 linked linear α-glucan, was the first microbial polysaccharide commercialized for medical applications. Advances in the discovery and characterization of these enzymes have remarkably enriched the available diversity with new catalysts. Research into their molecular mechanisms has highlighted important features governing their peculiarities thus opening up many opportunities for engineering these catalysts to provide new routes for the transformation of sucrose into value-added molecules. This article reviews these different aspects with the ambition to show how they constitute the basis for promising future developments