Ingénierie rationnelle de la dextrane-saccharase DSR-S : compréhension du mécanisme de\ud polymérisation pour la synthèse de dextranes de taille contrôlée

Abstract

La dextrane-saccharase DSR-S de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F catalyse à partir de\ud saccharose la synthèse d’un polymère d’unités glucosyle appelé dextrane, dont plus de 95% des\ud liaisons sont de type alpha-1,6. Ce polysaccharide trouve diverses applications, essentiellement\ud dans la formulation de composés pharmaceutiques, mais aussi comme support de\ud chromatographie et depuis peu comme agent texturant. L’objectif de cette thèse était\ud d’approfondir l’étude des relations structure-fonction de cette dextrane-saccharase, afin de\ud construire par ingénierie rationnelle des catalyseurs produisant des dextranes de taille, de structure\ud et donc de propriétés physico-chimiques contrôlées. L’expression hétérologue du gène dsrS dans\ud E. coli a été améliorée d’un facteur 30. Une forme tronquée a été construite de manière à pouvoir\ud purifier le catalyseur à homogénéité et disposer, pour la première fois, d’une préparation pure de\ud dextrane-saccharase spécifique des liaisons alpha-1,6. Un suivi cinétique de la synthèse de\ud dextrane nous a permis de mettre en évidence la formation de produits de taille intermédiaire au\ud cours de la réaction, dont la concentration et la taille augmentent au cours du temps. Un\ud mécanisme de polymérisation de type « semi-processif » n’impliquant qu’un seul site actif pour\ud l’élongation des dextranes peut donc être aujourd’hui proposé, mettant fin à une trentaine\ud d’années de polémiques. Enfin, l’identification de déterminants structuraux impliqués dans ce\ud mécanisme nous a permis de construire des formes tronquées synthétisant en une seule étape et\ud avec des rendements très avantageux (de 69 à 75 %) les dextranes de 10 000 et 40 000 Da les plus\ud utilisés à l’heure actuelle. Le motif minimal de DSR-S responsable de l’affinité pour le dextrane a\ud également été identifié, et la potentialité d’utiliser ce peptide comme étiquette d’affinité pour des\ud purifications sur gel Sephadex® évaluée. ________________________________________________________________________ Dextransucrase (DSR-S) from Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F catalyses from sucrose the synthesis of a polymer of D-glucosyl units called dextran, in which more than 95 % of the glucosyl units are a-1,6 linked. This polysaccharide has diverse applications, essentially for pharmaceutical compound formulations, but also as chromatographic support and more recently as texturing agent. The objective of the study was to improve our knowledge on the DSR-S structure-function relationships, in order to design new enzymes producing dextrans of controlled size, structure and physico-chemical properties. Heterologous expression of the dsrS gene by E. coli was optimised and the design of a truncated form allowed for the first time the high level purification of a dextransucrase specific for the a-1,6 linkage synthesis. A detailed characterization of the first steps of the polymer formation highlighted the formation of products of intermediate size during the reaction, for which the concentration and average molecular weight increase versus time. A “semi-processive” mechanism of polymerization, involving only one catalytic site for the chain elongation by their non-reducing extremity can thus be proposed. Finally, the identification of structural determinants involved in this process allowed the construction of truncated forms which synthesize, in only one step and with advantageous yields (69 to 75 %), the 10,000 and 40,000 Da dextrans the most widely used toda