Characterization of the gene sequence of the peptide transport protein (PepT1) in paiche Arapaima gigas fingerlings

El objetivo del estudio fue caracterizar el PepT1 del paiche Arapaima gigas mediante herramientas genómicas y proteómicas. Se realizó un análisis transcriptómico y proteómico a partir de secciones del intestino, bazo, hígado y riñón de alevines. El análisis transcriptómico permitió obtener dos secuencias consenso de 357 y 459 pb. Ambos fragmentos presentaron un alto grado de homología (78 y 80%), principalmente con secuencias de nucleótidos codificantes del PepT1 de Scleropages formosus del mismo Orden que el paiche. El análisis proteómico por espectrometría de doble masa MALDI TOF/TOF permitió identificar quince secuencias peptídicas del PepT1 en paiche. Como conclusión se logró caracterizar parcialmente el PepT1 en el intestino del paiche, las cuales podrán ser usadas para posteriores estudios sobre la evaluación de su expresión.The aim of this study was to characterize the PepT1 of pirarucu Arapaima gigas through genomic and proteomic tools. A transcriptomic and proteomic analysis was made from sections of the intestine, spleen, liver and kidney of fingerlings. The transcriptomic analysis allowed obtaining two consensus sequences of 357 and 459 bp. Both fragments showed a high degree of homology (78 and 80%), mainly with nucleotide sequences coding for the PepT1 of Scleropages formosus of the same Order as A. gigas. The proteomic analysis by double mass spectrometry MALDI TOF/TOF allowed to identify 15 peptide sequences of PepT1 in pirarucu. In conclusion, PepT1 was partially characterized in the intestine of pirarucu, which could be used for further studies on the evaluation of its expression

Caracterización molecular de los microorganismos presentes durante el proceso fermentativo de los granos de cacao (Theobroma cacao)

Cocoa beans fermentation is a spontaneous process of post-harvest very important for the development of chocolate aroma and flavor, which involves a number of complex microbial activities. In this work, we identify the microorganisms present in cocoa beans before, during and after the fermentation process, applying DNA sequencing analysis and MALDI TOF / TOF mass spectrometry. With the first method, the predominant bacteria and yeast identified were Lactobacillus plantarum (29%), L. brevis (18%), Bacillus cereus (15%), Pediococcus acidilactici (12%), and Pichia kudriavzevii (100%). The most important peptide sequences of each identified strain by mass fingerprint were characterized too. By the second method, 51 species of microorganisms being 73.7% bacterial species and 26.3% yeast species were identified. Additionally peptide sequences responsible Vicilin protein characteristic aroma of the fermented cocoa beans and the albumin protein of 21KDa were detected.La fermentación de granos de cacao es un proceso espontáneo de post cosecha muy importante para el desarrollo de aroma y sabor a chocolate el cual involucra un sin número de actividades microbianas complejas. En el presente estudio se identifican los microorganismos presentes en granos de cacao antes, durante y después del proceso de fermentación aplicando dos métodos: el análisis de secuenciamiento de ADN y la espectrometría de masas MALDI TOF/TOF. Dentro del grupo de bacterias y levaduras predominantes identificadas por el primer método se encontro a Lactobacillus plantarum (29%), L. brevis (18%), Bacillus cereus (15%), Pediococcus acidilactici (12%), y Pichia kudriavzevii (100%). Asimismo se caracterizó por huella de masas las secuencias peptídicas más importantes de cada cepa identificada. Por otro lado, aplicando el segundo método, se identificaron 57 especies de microorganismos, siendo el 73.7% especies bacterianas y el 26.3% especies de levaduras. Adicionalmente se detectaron secuencias peptídicas de la proteína vicilina responsable del aroma característico de los granos de cacao fermentados y a la proteína albumina de 21KDa

Diseño y evaluación de la expresión de una potencial vacuna de ADN contra el virus de la Tilapia de Lago (TiLV)

Tilapia Lake Virus (TiLV) is a pathogen that causes massive mortalities in both cultured and wild tilapia populations around the world. The development of an effective vaccine against this emerging pathogen is imperative to prevent economic losses. In this work an expression vector was designed and evaluated as a potential DNA vaccine against this virus. Initially, a threading analysis was done to predict the three-dimensional structures and functions of the TiLV proteins. Structural homologies were found between the TiLV proteins corresponding to the genomic segment 1 and the genomic segment 4, with the RNA-dependent RNA polymerase proteins of the influenza B virus (56%) and the neuraminidase protein belonging to the influenza A virus capsid (12%), respectively. The PCR product of the viral neuraminidase gene was inserted into the expression plasmid vector pCMV. Finally, the plasmid construct was injected into juveniles of the Nile tilapia Oreochromis niloticus and its expression was measured by real time RT-PCR at 8h, 16h, 24h, and 72h after the second immunizing injection. It was possible to detect gene expression in the four evaluated times and greater expression at 16 hours post injection. These results are the first step in the development of an effective vaccine for the protection of tilapia stocks around the world.El Virus de la Tilapia del Lago (TiLV), es un patógeno causante de mortalidades masivas tanto en poblaciones de tilapias cultivadas y silvestres alrededor del mundo. El desarrollo de una vacuna efectiva contra este patógeno emergente es imperativo para prevenir pérdidas económicas. En este trabajo se diseñó y evaluó un vector de expresión como una potencial vacuna de ADN contra este virus. Inicialmente, se realizó un análisis de enhebramiento para predecir las estructuras tridimensionales y las funciones de las proteínas del TiLV. Se encontraron homologías estructurales entre las proteínas correspondientes al segmento genómico 1 y al segmento genómico 4 del TiLV, con las proteínas de ARN polimerasa dependiente de ARN del virus de la influenza B (56%) y la proteína neuraminidasa que pertenece a la cápside del virus de la influenza A (12%), respectivamente. Se insertó el producto de PCR del gen neuraminidasa viral en el vector plasmídico de expresión pCMV. Finalmente, se inyectó el constructo plasmídico en juveniles de la tilapia del Nilo Oreochromis niloticus y se midió su expresión mediante RT-PCR en tiempo real a las 8h, 16h, 24h, 72h después de la segunda inyección inmunizante. Se logró detectar expresión génica en los cuatro tiempos evaluados, con mayor expresión a las 16 horas post inyección. Estos resultados constituyen el primer paso para el desarrollo de una vacuna efectiva para la protección de los stocks de tilapias alrededor del mundo

Optimización de un protocolo de inducción de genes inmunitarios (Dicer-2 – Argonaute-2) del camarón blanco Litopenaeus vannamei para su establecimiento como biomarcadores potenciales en programas de mejoramiento genético.

Como consecuencia de las grandes pérdidas económicas ocasionadas en el sector camaronero por el brote de enfermedades, la producción de lotes de camarones SPR ha empezado a tomar auge. Es por ello que varios trabajos de investigación han identificado diferentes efectores relacionados con la respuesta inmune celular y humoral, incluyendo el sistema ARNi, a fin de establecer marcadores moleculares aplicables dentro de los programas GAS. El estudio permitió determinar el patrón de expresión de dos de los principales genes (Dicer-2 y Argonaute-2) relacionados con el sistema ARNi como respuesta inmune antiviral en Litopenaeus vannamei. A partir de aplicación de dos inmunoestimulantes (LPS + Poly I:C) los niveles de expresión del gen Dicer-2 se incrementaron gradualmente durante las primeras 09H00 post-inducción, entre 6.5 (03H00), 8.8 (06H00) y 10.7 (09H00) veces mayores en comparación con los animales inyectados con SSC. Mientras que los niveles de expresión del gen Argonaute-2 alcanzaron un máximo pico a las 03H00 post-inducción (34.9 veces mayores que en los animales inyectados con SSC), en posteriores muestreos dichos valores disminuyeron drásticamente, pero se mantuvieron sobre expresados entre 06H00 (7.0), 09H00 (3.5) y 12H00 (1.2). Con los datos obtenidos se ha dado paso a la estandarización de un protocolo para la evaluación de los niveles de expresión de estos dos genes y su aplicación como marcadores moleculares, para la selección y el establecimiento de familias de camarones multiresistentes a infecciones virales dentro de los Programas de Mejoramiento Genético de Litopenaeus vannamei

Caracterización de la microbiota intestinal en robalo (Centropomus sp.) y aislamiento de bacterias probióticas potenciales

The aim of this study was to characterize the microbiota of the intestinal tract of robalo (Centropomus sp), from natural environment and captivity, and to isolate and identify bacteria with probiotic potential. The intestinal microbiota was characterized by metagenomics directed to the 16S rRNA gene. In addition, samples of intestinal mucus were cultured in MRS medium for bacterial isolation. Molecular identification was done by sequencing the 16S rRNA gene. Probiotic capabilities were evidenced by proteolytic and bacterial antagonism assays against Plesiomona shigelloides, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii and Vibrio harveyi. The most abundant bacterial genera were Clostridium, Photobacterium, Cetobacterium and Rubritepida. Bacterial species, including Klebsiella sp, two strains of Weisiella cibaria and Lactococcus sp were isolated on MRS agar from the intestinal tract. W. cibaria strains showed broad antagonistic spectrum and positive proteolytic activity.El objetivo del estudio fue caracterizar la microbiota del tracto intestinal de robalo (Centropomus sp), proveniente de medio natural y cautiverio, además de aislar e identificar bacterias con potencial probiótico. La microbiota intestinal se caracterizó mediante metagenómica dirigida al gen 16S ARNr. Además, se sembraron muestras de mucus intestinal en medio de cultivo MRS para el aislamiento bacteriano. La identificación molecular se hizo mediante la secuenciación del gen 16S ARNr. Las capacidades probióticas se evidenciaron mediante ensayos proteolíticos y de antagonismo bacteriano frente a Plesiomona shigelloides, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii y Vibrio harveyi. Los géneros bacterianos con mayor abundancia fueron Clostridium, Photobacterium, Cetobacterium y Rubritepida. Las especies bacterianas, incluyendo Klebsiella sp, dos cepas de Weisiella cibaria y Lactococcus sp fueron aisladas en agar MRS a partir del tracto intestinal. Las cepas W. cibaria mostraron amplio espectro antagonista y actividad proteolítica positiva

Optimización de un protocolo para la criopreservación del espermatóforo y masa espermática del langostino blanco Litopenaeus vannamei (Boone, 1931)

The effect of six cryoprotective solutions based on MgCl2 and methanol, in addtion with sucrose and 10% Aloe vera gel or 10% egg yolk, on the sperm viability in spermatophore and sperm mass of Litopenaeus vannamei was evaluated. Besides, cooling rates of -0.5, -1 and -2 °C/min were used until temperature reached -35, -80 and -100 °C prior to immersion in liquid nitrogen. The sperm viability rate was determined by eosin-nigrosin staining. The results showed that the solutions based on MgCl2, sucrose plus egg yolk or Aloe vera gel better preserved sperm viability in spermatophore (82.8 ± 2.3% and 72.6 ± 3.1%) and in sperm mass (83.4 ± 2.5% and 76 ± 1.1%) without significant differences with the control group (p>0.05). The freezing curve showing less damage in spermatophore started from 25 °C and reached -35 °C with a rate of -1 °C/min using a cryoprotective solution with egg yolk and MgCl2, showing a sperm viability greater than 80% without significant differences with the control group (p>0.05), and a rate of -2 °C/min in the same temperature range for the group with sperm mass and a solution based on Aloe vera gel. In conclusion, the use of a solution based of MgCl2, sucrose, Aloe vera gel or egg yolk and at a cooling rate of -1 °C/min or -2 °C/min until reaching -35 °C allows a successful freezing of spermatophores or sperm of Litopenaeus vannamei.  Se evaluó el efecto de seis soluciones crioprotectoras basadas en MgCl2 y metanol, acompañado de sucrosa y gel de Aloe vera al 10% o yema de huevo al 10%, sobre la viabilidad espermática en espermatóforo y masa espermática de Litopenaeus vannamei. Además, se usaron tasas de enfriamiento de -0.5, -1 y -2°C/min hasta lograr descensos de temperatura a -35, -80 y -100 °C previo a la inmersión en nitrógeno líquido. La tasa de viabilidad espermática fue determinada mediante la tinción eosina-nigrosina. Los resultados mostraron que las soluciones basadas en MgCl2, sucrosa más yema de huevo o gel de Aloe vera preservaron mejor la viabilidad espermática en espermatóforo (82.8 ± 2.3% y 72.6 ± 3.1%) y en masa espermática (83.4 ± 2.5% y 76 ± 1.1%), sin diferencias significativas con el grupo control (p>0.05). La curva de congelamiento que mostró menor daño en espermatóforo inició desde 25 °C y llegó a -35 °C con una tasa de -1 °C/min empleando una solución crioprotectora con yema de huevo y MgCl2, mostrando una viabilidad espermática mayor a 80% sin diferencias significativas con el grupo control (p>0.05), y una tasa de -2 °C/min en el mismo rango de temperaturas para el grupo con masa espermática y una solución basada en gel de Aloe vera. En conclusión, el uso de una solución compuesta por MgCl2, sucrosa, gel de Aloe vera o yema de huevo y una tasa de enfriamiento de -1°C/min o -2°C/min hasta alcanzar -35°C permite un exitoso congelamiento de espermatóforos o masa espermática de Litopenaeus vannamei

Selection of shrimp breeders free of white spot syndrome and infectious hypodermal and hematopoietic necrosis

The objective of this work was to select surviving breeders of Litopenaeus vannamei from white spot syndrome virus (WSSV) outbreak, adapted to local climatic conditions and negatively diagnosed for WSSV and infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV), and to evaluate if this strategy is a viable alternative for production in Santa Catarina, Brazil. A total of 800 males and 800 females were phenotypically selected in a farm pond. Nested-PCR analyses of 487 sexually mature females and 231 sexually mature males showed that 63% of the females and 55% of the males were infected with IHHNV. Animals free of IHHNV were tested for WSSV, and those considered double negative were used for breeding. The post-larvae produced were stocked in nine nursery tanks for analysis. From the 45 samples, with 50 post-larvae each, only two were positive for IHHNV and none for WSSV. Batches of larvae diagnosed free of virus by nested-PCR were sent to six farms. A comparative analysis was carried out in growth ponds, between local post-larvae and post-larvae from Northeast Brazil. Crabs (Chasmagnathus granulata), blue crabs (Callinectes sapidus), and sea hares (Aplysia brasiliana), which are possible vectors of these viruses, were also evaluated. The mean survival was 55% for local post-larvae against 23.4% for post-larvae from the Northeast. Sea hares showed prevalence of 50% and crabs of 67% of WSSV. O objetivo deste trabalho foi selecionar reprodutores de Litopenaeus vannamei sobreviventes de um surto do vírus da síndrome da mancha-branca (WSSV), adaptados às condições locais e diagnosticados negativamente para WSSV e para o vírus da necrose infecciosa hipodermal e hematopoiética (IHHNV), e avaliar se esta extratégia é uma alternativa viável para produção em Santa Catarina. Foram selecionados fenotipicamente 800 machos e 800 fêmeas, de um viveiro. Análises de nested-PCR de 487 fêmeas e de 231 machos, sexualmente maduros, mostraram que 63% das fêmeas e 55% dos machos estavam infectados com IHHNV. Os animais livres de IHHNV foram testados para WSSV, e os considerados duplo negativos destinados à reprodução. As pós-larvas produzidas foram estocadas em nove berçários, para análise. Das 45 amostras, com 50 pós-larvas cada, apenas duas foram positivas para IHHNV e nenhuma para WSSV. Os lotes de pós-larvas diagnosticadas livres de vírus por nested-PCR foram encaminhados para seis fazendas. Foi realizada análise comparativa em viveiros de engorda, entre pós-larvas locais e pós-larvas do Nordeste do Brasil. Também foram analisados caranguejos (Chasmagnathus granulata), siris (Callinectes sapidus) e lebres do mar (Aplysia brasiliana), que são possíveis vetores dos vírus. A média de sobrevivência foi de 55% para as pós-larvas locais e de 23,4% para as pós-larvas do Nordeste. As lebres do mar apresentaram prevalência de 50% e os caranguejos de 67% de WSSV