Membrane-type matrix metalloproteinases (MT-MMPs) in tumor metastasis

金沢大学がん研究所がん病態制御Activated gelatinase A is reportedly associated with tumor spread. We identified novel matrix metalloproteinases that localize on the cell surface and mediate the activation of progelatinase A. Thus, these progelatinase A activators were named membrane-type matrix metalloproteinase-1 and -2 (MT-MMP-1 and -2, respectively). MT-MMP-1 is overexpressed in malignant tumor tissues, including lung and stomach carcinomas that contain activated gelatinase A. This suggests that MT-MMP-1 is associated with the activation of progelatinase A in these tumor tissues. The expression of MT-MMP-1 also induced binding of gelatinase A to the cell surface by functioning as a receptor. The cell surface localization of proteinases has advantages over pericellular proteolysis. MT-MMP1 and its family may play a central role in the cell surface localization and activation of progelatinase A and via this mechanism, tumor cell use exogenous progelatinase A to mediate the proteolysis associated with invasion and metastasis

Integrated functions of membrane-type 1 matrix metalloproteinase in regulating cancer malignancy: Beyond a proteinase

Membrane-type 1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP) is expressed in different types of invasive and proliferative cells, including cancer cells and stromal cells. MT1-MMP cleaves extracellular matrix proteins, membrane proteins and other pericellular proteins, thereby changing the cellular microenvironment and regulating signal activation. Critical roles of protease activity in cancer cell proliferation, invasion and metastasis have been demonstrated by many groups. MT1-MMP also has a non-protease activity in that it inhibits the oxygen-dependent suppression of hypoxia-inducible factors (HIFs) via Munc18-1-interacting protein 3 (Mint3) and thereby enhances the expression of HIF target genes. Elevated HIF activity in MT1-MMP-expressing cancer cells is a fundamental mechanism underlying the Warburg effect, a well-known phenomenon where malignant cancer cells exhibit a higher rate of glucose metabolism. Because specific intervention of HIF activation by MT1-MMP suppresses tumor formation by cancer cells in mice, both the proteolytic and non-proteolytic activities of MT1-MMP are important for tumor malignancy and function in an integrated manner. In this review, we summarize recent findings relating to how MT1-MMP activates HIF and its effects on cancer cells and stromal cells. © 2017 The Authors. Cancer Science published by John Wiley & Sons Australia, Ltd on behalf of Japanese Cancer Association

Proteolytic activation of the precursor of membrane type 1 matrix metalloproteinase by human plasmin A possible cell surface activator

AbstractMembrane type 1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP) was suggested to play a critical role in the regulation of tissue invasion by normal and neoplastic cells by directly mediating the activation of pro-gelatinase A. Recently, the proteolytic activation of a pro-MT1-MMP by an intracellular proprotein convertase, furin, was reported. In this study, we found that plasmin efficiently activates the pro-MT1-MMP by cleaving immediately downstream of Arg108 and Arg111 in the multi-basic motif between its pro- and catalytic domains that participates in the activation of pro-gelatinase A. Our present data suggest that pro-MT1-MMP transported to the plasma membrane is activated by plasmin extracellularly and thus it may play an important role in the matrix degradation process

Cytoplasmic tail–dependent internalization of membrane-type 1 matrix metalloproteinase is important for its invasion-promoting activity

Membrane-type 1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP) is an integral membrane proteinase that degrades the pericellular extracellular matrix (ECM) and is expressed in many migratory cells, including invasive cancer cells. MT1-MMP has been shown to localize at the migration edge and to promote cell migration; however, it is not clear how the enzyme is regulated during the migration process. Here, we report that MT1-MMP is internalized from the surface and that this event depends on the sequence of its cytoplasmic tail. Di-leucine (Leu571–572 and Leu578–579) and tyrosine573 residues are important for the internalization, and the μ2 subunit of adaptor protein 2, a component of clathrin-coated pits for membrane protein internalization, was found to bind to the LLY573 sequence. MT1-MMP was internalized predominantly at the adherent edge and was found to colocalize with clathrin-coated vesicles. The mutations that disturb internalization caused accumulation of the enzyme at the adherent edge, though the net proteolytic activity was not affected much. Interestingly, whereas expression of MT1-MMP enhances cell migration and invasion, the internalization-defective mutants failed to promote either activity. These data indicate that dynamic turnover of MT1-MMP at the migration edge by internalization is important for proper enzyme function during cell migration and invasion

膜型メタロプロテイナーゼ(MFMMP)と乳癌の転移

東京大学 / 金沢大学医学部1、MT1-MMPが様々な癌組織(肺癌、胃癌、上咽頭癌、大腸癌、乳癌、グリオブラストーマなど)で発現しており、gelatinase A活性化と相関し、リンパ節転移とも相関した。2、大腸菌で発現させた酵素を用いることにより、MT1-MMPがプロテアーゼを介することなく直接ゼラチナーゼAの活性化を行うことを明らかにした。3、胃癌組織を免疫染色する事により、癌細胞でMT1-MMPとgelatinase Aが共に強陽性であった。また、周辺の線維芽細胞にも両者の発現が認められた。4、大腸癌組織のin situ hybridizationによる検索でMT1-MMPは癌細胞自身と周辺の線維芽細胞で発現しており、ゼラチナーゼAは維線芽細胞だけで発現していた。5、MT1-MMPと近縁のMT2-MMP,MT3-MMPについての検討も浸潤性乳癌に20例に対して加えた。Nor ther n biottingによるmRNA発現がMT1-MMPでは前例で認められたのに対して、MT2-MMPは25%また、MT3-MMPは認められなかった。6、細胞表層でのゼラチナーゼA活性化に対するTIMP-2の役割をインビトロの実験モデルを構築して調べることにより、TIMP-2がMT1-MMPにゼラチナーゼAを結合させるアダプター分子として機能し、MT1-MMPが存在する部位へとゼラチナーゼAを濃縮する役割を担っていることを明らかにした。7、MT2-MMPおよびMT3-MMPもMT1-MMPと同様にゼラチナーゼAを活性化することをトランスフェクション実験によって明らかにした。Gelatinase A (GelA) is believed to be important for cancer cell invasion and metastasis. Gelatinase A is produced as an inactive proenzyme (proGelA) and activated by a cell surface activator on cancer cells. We identified membrane-type 1 matrix metalloproteinase as a possible cell surface activator in 1994 and have extended the study to elucidate its relevance to cancer including breast carcinomas. During the three years we obtained the following results supported by the grant.1. MT1-MMP expression was demonstrated in various types of human cancers such as breast, gastric, colon, head and neck, and nasophagial carcinomas.2. Expression of MT1-MMP in carcinomas correlated well to the activation of GelA in the tissue suggesting that MT1-MMP is surely the GelA activator in cancers.3. Immunohistochmistry localized both MT1-MMP and gelatinase A to the cancer cells and also surrounding stromal fibroblasts.4. However carcinoma cells did not express GelA but it was expressed in the surrounding fibroblasts.5. MT1-MMP was shown to bind proGelA by using TIMP-2 as a adapter. Thus Three molecular complex is thought to be formed on cancer cell surface. ProGelA in the complex is thought to be activated by the neighboring free MT1- MMP.研究課題/領域番号:07044240, 研究期間(年度):1995 – 1997出典：研究課題「膜型メタロプロテイナーゼ(MFMMP)と乳癌の転移」課題番号07044240（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-07044240/070442401997kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作

癌遺伝子rasによる高転移性獲得過程の分子生物学的解析

金沢大学がん研究所癌の転移は癌患者の死因の大半を占めている。しかし、転移を防ぐ有効な方法は未だ確立されていない。その原因の一つは、転移の成立過程は複雑であり、その成立機序の解析が困難であったことによる。本研究では癌細胞の転移能と良く相関している基底膜の浸潤能のステップに焦点を絞って解析を進めた。用いた細胞はNIH3T3であり、ras癌遺伝子の導入によって高転移性にトランスフォームした細胞での変化を調べた。癌細胞の運動性の昂進は、基底膜を破壊しながら通過する際に必要とされる性質である。ras癌遺伝子の導入による細胞の運動性昂進の機序に着目して以下のことを明らかにした。1、ras遺伝子の導入によって自らの運動性を刺激するAutocrine Motility Factor(AMF)の産生が昂進していた。2、AMFに対する反応性にはras遺伝子の導入によって変化がないことから、運動性の昂進はAMFの産生量の増大によると結論される。3、AMFはクロマトグラフ的に単一成分からなる。4、ヒトメラノーマで最初のAMFが報告されているが、それとは見かけの分子量や安定性などの点で異なる。5、NIH3T3のAMFとヒトメラノーマ細胞のAMFの作用はGタンパク・インヒビターに対する感受性が異なること、また二つのAMFがそれぞれの細胞に対して相加的に働くことから細胞の受容体も異なると考えられる。以上のことから、rasトランスフォーマントでもAutocrineの機構で運動性の昂進が引き起こされていることが明らかになった。研究課題/領域番号:01015032, 研究期間(年度):1989出典：「癌遺伝子rasによる高転移性獲得過程の分子生物学的解析」研究成果報告書　課題番号01015032（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-01015032/）を加工して作

がん細胞の浸潤性獲得の分子機構

金沢大学がん研究所清木班員はヒト胃癌細胞株を用いて実験的にマトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)の活性発現が必須であることを特異的インヒビターであるTIMP-1遺伝子導入実験により示した.同時に、TIMP-1発現の低下が悪性形質発現の一因となることも示された.岡田班員はヒト骨肉腫OST細胞、ヒト単球様細胞U937を用いて細胞の浸潤能および転移能の発現とIV型コラーゲナーゼ(MMP-9)の発現との相関が高いことを示した.中島班員は腎臓癌細胞KG12がヌードマウスへの正所移植では転移するが異所である皮下からは転移しないことを示した.組織由来の線維芽細胞が産生するTGFbがKG12細胞のIB型コラーゲナーゼおよびウロキナーゼ産生と浸潤能発現の制御因子であることを明らかにした.浸潤・転移能に関連して重要性が示されたMMP-9遺伝子発現制御機構を解析することにより、佐藤班員はTPA、TNFaとc-Srcを介するシグナルがそれぞれ独立にMMP-9の伝写を制御していることを明らかにした.MMP以外の浸潤能に関する細胞外マトリックス分解酵素として宮崎班員は胃癌細胞株からトリプシン1を精製し、同定した.早川班員はもう一つのMMPインヒビターであるTIMP-2に対する単クローン抗体を作成し、サンドイッチELISA法による測定系を確立した.木村班員は転移抑制遺伝子として報告されたNKPキナーゼ(NM23)遺伝子の二つのアイソフォームをラットからcDNAと対応する染色体遺伝子として単離し、その構落を明らかにした.また、ラット高転移性乳癌細胞での発現低下を確認した.谷口班員はbmアクチンの転移の抑制活性が細胞運動の抑制と相関しすることを明らかにした.若い研究者伊藤君は大腸癌でMMP-7の発現が特異的に見られること丹田君は血管作動薬による腫瘍組織血流量の増加が化学療法剤の効果を増強することを見いだした.研究課題/領域番号:04151024, 研究期間(年度):1992出典：「がん細胞の浸潤性獲得の分子機構」研究成果報告書　課題番号04151024（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-04151024/）を加工して作

EBウイルス・LMPを用いての細胞接着を介したシグナル伝達系の解析

金沢大学がん研究所EBVのトランスフォーミング遺伝子産物であるLMP蛋白はビンキュリン、srcファミリー・キナーゼなどの細胞性蛋白質と結合することが報告されている。これらの蛋白質は細胞・細胞間あるいは細胞・基質間接着装置の裏打ち構造に存在する。特にsrcファミリー・キナーゼは細胞接着により生ずるシグナルを核に伝達する可能性があり、LMP蛋白がsrcファミリー・キナーゼを介するシグナル伝達系を解析する道具になりうるかどうかを検討した。まず、srcによるシグナルで制御される遺伝子として92-kDa type IV collagenase遺伝子があることを見いだした。その発現誘導機構の解析をプロモーター領域を単離して行なった。その結果、本遺伝子の発現は炎症性サイトカインとv-Srcに代表されるシグナルによってそれぞれ独立に制御されることが明かとなった。v-Srcシグナルによる発現誘導には転写因子AP-1の結合部位とRCE(Rb control element)が必須であった。細胞によってv-Srcシグナルに応答するかどうかはRCEに結合する核因子が存在するか否かによっていることが明かとなった。LMPの発現プラスミドを構築し、トランスフェクションによって蛋白質の発現が見られることを確認した。そこで、LMPの発現がv-Srcシグナルと同様のシスエレメントを介して92-kDa type IV collagenase遺伝子プロモーター活性に及ぼすかどうかを様々な細胞を用いてトランジエントトランスフェクション法にて検討中である。未だ予備的な結果で結論を出すまでにはいたっていないが、さらに実験を継続することにより答えが得られそうなところまで来ている。研究課題/領域番号:05807012, 研究期間(年度):1993出典：研究課題「EBウイルス・LMPを用いての細胞接着を介したシグナル伝達系の解析」課題番号05807012（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-05807012/）を加工して作

癌遺伝子rasによる高転移性獲得過程の分子生物学的解析

金沢大学がん研究所がん細胞の浸潤能に関係する因子としてメタロプロテア-ゼとTIMPに着目し、まずは報告された遺伝子配列に基づいて72kDa,92kDaIV型コラ-ゲナ-ゼ、ストロムライシン、TIMPのcDNAクロ-ンをPCR法で単離した。また、TIMP関連蛋白質の部分的アミノ酸配列を入手し、これを基に合成DNAプロ-ブを調整して新しいTIMP遺伝子のcDNAをクロ-ニングした。しかし、これは本年、L.Liottaらが報告したTIMPー2と同一であることが判明した。上記のcDNAをプロ-ブとして用いて、様々ながん遺伝子でトランスフォ-ムしたNIH3T3細胞の転移・浸潤能との関連を調べた。1、転移能は鶏卵法を用いて調べた。ヌ-ドマウスによる実験的転移能の解析で報告されている結果と一致して、ここでもrasトランスフォ-マントがもっとも強い転移能を示し、src,fos,ablもrasほどではないが明らかに造腫瘍性と転移能を増加させた。2、ノ-ザン法でメタロプロテア-ゼ、インヒビタ-の発現を調べると、親株のNIH3T3で既に72kDa,92kDaコラ-ゲナ-ゼ、ストロムライシンが発現しており、細胞の転移能との相関は認められなかった。TIMP,TIMPー2の発現量にもトランスフォ-メ-ションや転移能と相関した変化はなかった。3、前年度にrasトランスフォ-マントではAutocrine Motility Factorの産生が昂進していることを報告した。本年度の結果と合わせて考えると、ras遺伝子による高転移性のNIH3T3細胞では浸潤性の昂進は細胞外マトリックスの分解能の昂進よりもむしろ運動性の昂進によって引き起こされていると考えられる。研究課題/領域番号:02152041, 研究期間(年度):1990出典：「癌遺伝子rasによる高転移性獲得過程の分子生物学的解析」研究成果報告書　課題番号02152041（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-02152041/）を加工して作