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Functional real-time analysis of the cellular and molecular mechanisms of neuronal dysfunction in chronic neuroinflammation
FĂŒr das VerstĂ€ndnis der Pathomechnismen in der Multiplen Sklerose (MS) ist die
Darstellung funktioneller ZusammenhĂ€nge maĂgeblich, mit bisher angewendeten
Methoden jedoch nur bedingt möglich. In dieser Arbeit wurde die
Zweiphotonenmikroskopie (TPLSM) auch in Kombination mit
Fluoreszenzlebensdauermessung (FLIM) sowohl intravital im Tiermodell als auch
in vitro an Patientenzellen genutzt, um die Reaktionen des Gewebes auf die
Immunzellinvasion zu untersuchen. Hierbei wurde deutlich, dass das Gewebe des
zentralen Nervensystems (ZNS) selbst entscheidende Ănderungen in Form von
Ausbildung eines retikulÀren Fasernetzwerkes vollzieht, die es erst
ermöglichen, dass massenweise periphere Immunzellen einwandern. Die
Immunzellen fĂŒhren direkt und indirekt zur neuronalen Dysfunktion, welche
mittels Messung der intrazellulÀren neuronalen Calciumkonzentration intravital
analysiert wurde. DarĂŒber hinaus konnte erstmals gezeigt werden, dass die
AktivitÀt der NADPH-Oxidase (NOX) als Entstehungsort reaktiver
Sauerstoffspezies (ROS) in direkter Korrelation mit der neuronalen Dysfunktion
steht. Die Zellen, die fĂŒr die Produktion der ROS im zentralen Nervensystem
verantwortlich sind, waren neben peripheren eingewanderten Makrophagen und
ortststĂ€ndigen Mikroglia auch zu einem groĂen Teil Astrozyten. Die systemische
Komponente der MS spiegelte sich in der Ăberaktivierung der NOX in peripheren
CD11b+-Zellen mit signifikanten Unterschieden zwischen den Erkrankungsstadien
bei MS-Patienten im Vergleich zu gesunden Probanden und Patienten wider. Eine
Behandlung mit dem Antioxidans Epigallokatechingallat, einem Extrakt aus
grĂŒnem Tee, senkte die NOX-Aktivierung auf gesunde Werte. Insgesamt zeigt
diese Arbeit neue ZugÀnge auf, funktionelle ZusammenhÀnge neuroimmunologischer
Erkrankungen im lebendigen Gewebe in Echtzeit zu erforschen.To fully understand the underlying pathological mechanisms of multiple
sclerosis (MS), it is crucial to register and comprehend its functional
dynamics. Yet until now, due to the lack of adequate detection methods, many
interrelations in cell and metabolism dynamics remain elusive. In this work we
introduced two-photon fluorescence microscopy (TPLSM) and its combination with
NAD(P)H-fluorescence lifetime imaging (FLIM) both in an animal model for MS as
well as human blood cells to investigate tissue and cell response to immune
cell invasion. Thereby it became apparent how the central nervous system
tissue itself undergoes changes in its extracellular matrix by developing a
reticular meshwork that allows peripheral immune cells to infiltrate
inflammatory lesions. These immune cells lead to neuronal dysfunction, which
was analyzed through measuring intracellular neuronal calcium concentrations
in vivo. Furthermore we showed for the first time how the activity of NADPH
oxidase (NOX), the main source of reactive oxygen species (ROS), is directly
correlated with neuronal dysfunction. The cellular source and the dynamics of
ROS production were undetermined up to now, since freely diffusing ROS
molecules cannot be localized and their production requires the assembly and
not the mere expression of NOX subunits. Using intravital TPLSM and
NAD(P)H-FLIM we identified infiltrating peripheral monocytes, activated
resident microglia and astrocytes as the main cellular sources of ROS in EAE
brainstem lesions. The systemic dimension of MS was mirrored in the over-
activation of NOX enzymes in peripheral CD11b+ cells with significant
differences between MS patients compared to healthy subjects. Administration
of the anti-oxidant epigallocatechin-3-gallate, a green tea extract,
counteracted this effect. Overall, this work establishes new intravital
approaches to explore functional contexts in neuroinflammation and
neurodegeneration in real time