Comparative Docking to Distinct G Protein–Coupled Receptor Conformations Exclusively Yields Ligands with Agonist Efficacy

G protein-coupled receptors exist in a whole spectrum of conformations which are stabilised by the binding of ligands with different efficacy or intracellular effector proteins. Here, we investigate whether three-dimensional structures of receptor conformations in different states of activation can be utilised to enrich ligands with agonist behaviour in prospective docking calculations. We focused on the β2-adrenergic receptor, as it currently is the receptor with the highest number of active-state crystal structures. Comparative docking calculations to distinct conformations of the receptor were used for the in silico prediction of ligands with agonist efficacy. The pharmacology of molecules selected based on these predictions was characterised experimentally, resulting in a hit rate of 37% ligands, all of which were agonists. The ligands furthermore contain a pyrazole moiety which has previously not been described for β2 -adrenergic receptor ligands and one of them shows an intrinsic efficacy comparable to salbutamol

Differential interaction patterns of opioid analgesics with µ opioid receptors correlate with ligand-specific voltage sensitivity

The µ opioid receptor (MOR) is the key target for analgesia, but the application of opioids is accompanied by several issues. There is a wide range of opioid analgesics, differing in their chemical structure and their properties of receptor activation and subsequent effects. A better understanding of ligand-receptor interactions and the resulting effects is important. Here, we calculated the respective binding poses for several opioids and analyzed interaction fingerprints between ligand and receptor. We further corroborated the interactions experimentally by cellular assays. As MOR was observed to display ligand-induced modulation of activity due to changes in membrane potential, we further analyzed the effects of voltage sensitivity on this receptor. Combining and approaches, we defined discriminating interaction patterns responsible for ligand-specific voltage sensitivity and present new insights into their specific effects on activation of the MOR. [Abstract copyright: © 2023, Kirchhofer et al.

Multisite phosphorylation is required for sustained interaction with GRKs and arrestins during rapid -opioid receptor desensitization

Copyright © 2018 The Authors. G protein receptor kinases (GRKs) and -arrestins are key regulators of -opioid receptor (MOR) signaling and trafficking. We have previously shown that high-efficacy opioids such as DAMGO stimulate a GRK2/3-mediated multisite phosphorylation of conserved C-terminal tail serine and threonine residues, which facilitates internalization of the receptor. In contrast, morphine-induced phosphorylation of MOR is limited to Ser375 and is not sufficient to drive substantial receptor internalization. We report how specific multisite phosphorylation controlled the dynamics of GRK and -arrestin interactions with MOR and show how such phosphorylation mediated receptor desensitization. We showed that GRK2/3 was recruited more quickly than was -arrestin to a DAMGO-activated MOR. -Arrestin recruitment required GRK2 activity and MOR phosphorylation, but GRK recruitment also depended on the phosphorylation sites in the C-terminal tail, specifically four serine and threonine residues within the 370TREHPSTANT379 motif. Our results also suggested that other residues outside this motif participated in the initial and transient recruitment of GRK and -arrestins. We identified two components of high-efficacy agonist desensitization of MOR: a sustained component, which required GRK2-mediated phosphorylation and a potential soluble factor, and a rapid component, which was likely mediated by GRK2 but independent of receptor phosphorylation. Elucidating these complex receptor-effector interactions represents an important step toward a mechanistic understanding of MOR desensitization that leads to the development of tolerance and dependence

Increased Expression of the Auxiliary β(2)-subunit of Ventricular L-type Ca(2+) Channels Leads to Single-Channel Activity Characteristic of Heart Failure

BACKGROUND: Increased activity of single ventricular L-type Ca(2+)-channels (L-VDCC) is a hallmark in human heart failure. Recent findings suggest differential modulation by several auxiliary β-subunits as a possible explanation. METHODS AND RESULTS: By molecular and functional analyses of human and murine ventricles, we find that enhanced L-VDCC activity is accompanied by altered expression pattern of auxiliary L-VDCC β-subunit gene products. In HEK293-cells we show differential modulation of single L-VDCC activity by coexpression of several human cardiac β-subunits: Unlike β(1) or β(3) isoforms, β(2a) and β(2b) induce a high-activity channel behavior typical of failing myocytes. In accordance, β(2)-subunit mRNA and protein are up-regulated in failing human myocardium. In a model of heart failure we find that mice overexpressing the human cardiac Ca(V)1.2 also reveal increased single-channel activity and sarcolemmal β(2) expression when entering into the maladaptive stage of heart failure. Interestingly, these animals, when still young and non-failing (“Adaptive Phase”), reveal the opposite phenotype, viz : reduced single-channel activity accompanied by lowered β(2) expression. Additional evidence for the cause-effect relationship between β(2)-subunit expression and single L-VDCC activity is provided by newly engineered, double-transgenic mice bearing both constitutive Ca(V)1.2 and inducible β(2) cardiac overexpression. Here in non-failing hearts induction of β(2)-subunit overexpression mimicked the increase of single L-VDCC activity observed in murine and human chronic heart failure. CONCLUSIONS: Our study presents evidence of the pathobiochemical relevance of β(2)-subunits for the electrophysiological phenotype of cardiac L-VDCC and thus provides an explanation for the single L-VDCC gating observed in human and murine heart failure

Membrane-delimited activation of muscarinic K current by an albumin-associated factor in guinea-pig atrial myocytes

No abstract availabl

Interaction dynamics between heterotrimeric G-proteins and type V adenylyl cyclase determine sensitivity of effector regulation

The signalling pathway from G-protein-coupled receptors to the second messenger cAMP is present in virtually all cells and of major physiological and pathophysiological importance. The membrane-spanning receptors can easily be targeted by pharmaceutical compounds and therapies to treat diseases like hypertension, asthma or pain affect cellular cAMP-levels. Biochemical studies have revealed a lot of important information about the interaction of the proteins participating in this signalling cascade, namely the receptors, the G-proteins and adenylyl cyclases. The development of new microscopic methods allowed to dynamically investigate protein/protein-interactions. While these techniques have already been widely used to investigate in vivo signalling dynamics of the receptors, G-proteins and second messengers, research on adenylyl cyclases (ACs) mainly relied on in vitro methods or steady-state interaction studies. An assay, based on Förster Resonance Energy Transfer (FRET), was developed within this study, to investigate the dynamic interaction between G-proteins and ACs in living cells, thereby providing a platform for biochemical analysis in vivo. Furthermore, a protocol was established to resolve Gi protein-mediated regulation of cAMP in single living cells by means of FRET. For the assays, a fluorescently labelled AC5 was cloned. Bioluminescence-based cAMP measurements proved the constructs wild-type-like functionality with respect to stimulation through forskolin and Gs-proteins. The new protocol for FRET-based cAMP measurements verified Gs- and Gi-protein signalling competence of the labelled AC5. The new assay was used to analyse agonist-dependent interaction between AC5 and Gαs-, Gαi1- and Gβ1γ2-subunits, respectively. Although no basal interaction between the G-protein subunits and AC5 was observed, all subunits showed an increase in FRET upon agonist-stimulation of the according receptors. Interestingly, the different combinations of AC5 and G-protein subunits showed distinct FRET-signals. The agonist-dependent Gβ1γ2/AC5-FRET increase and decrease followed an exponential course, closely resembling other FRET-signals observed for G-proteins. FRET between Gαs and AC5 was characterised by a transient peak in the onset of the signal. Contrastingly, Gαi1 and AC5 showed an additional transient increase in their FRET-signal upon agonist withdrawal. The signal-phenotypes observed between Gα-subunits and AC5 possibly indicate additional conformational changes within the G-protein/AC5 complex. The onset-kinetics of the interaction between AC5 and G-protein-subunits were fast and in the same range as previously observed G-protein activation-kinetics. The interaction between Gαi1 and AC5 was found to be especially sensitive and proved to be left-shifted in comparison to the activation of the Gi1-protein itself. Downstream events of Gi-dependent regulation of AC5 and Gi-protein activity further verified this difference on a functional level. Gi-dependent inhibition of AC5-regulated cAMP levels was determined with the newly established protocol for the FRET-based cAMP sensor Epac1-camps. In comparison to GIRK currents, which reflect Gi1 protein activity, the receptor-induced Gi-protein-mediated inhibition of stimulated AC5 activity was shifted by two orders of magnitude. This was in line with previous reports on higher sensitivity of cAMP-involving over Gi-protein activity-dependent pathways. After appropriate controls ruled out confounding mechanisms that could shift the apparent sensitivity of the assay, the interaction kinetics between AC5 and Gαi1 remained as a major contributing cause. Indeed the interaction of Gαi1-subunits with AC5 was prolonged in comparison to the deactivation of the Gi1-protein and could not be accelerated by RGS4. This indicates a slow dissociation of AC5 and Gαi1, which prevents the deactivation and reassembly of the Gi1 protein, thereby affecting the dynamics of the G-protein cycle. Presumably, the balance in the G protein cycle between inactive and active G-proteins is shifted towards a higher amount of AC5-bound active G-proteins, providing the putative molecular mechanism for the high sensitivity observed in the interaction studies

Pharmakologie und Spannungsabhängigkeit ausgewählter Prostanoid-Rezeptoren

G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) stellen die größte Familie transmembranärer Rezeptoren im menschlichen Genom dar. 34% der 2017 von der FDA zugelassenen Wirkstoffe haben einen GPCR als Zielstruktur, weshalb diese Rezeptorgruppe im Fokus der pharmakologischen Forschung steht (Hauser et al., 2017). GPCRs als integrale Membranproteine sind einem starken elektrischen Feld ausgesetzt, das natürlichen Schwankungen unterliegt. Vor mittlerweile über 15 Jahren konnte erstmals für Vertreter dieser Gruppe gezeigt werden, dass die Agonist-induzierte Rezeptoraktivität durch Änderungen des Membranpotentials (VM) moduliert wurde (Ben-Chaim et al., 2003). Obwohl seitdem bereits einige Zeit vergangen ist und an diesem Thema intensiv geforscht wurde, konnten viele sich aus dieser Entdeckung ergebende Fragen noch nicht oder nur teilweise beantwortet werden. So ist bis heute keine allgemein gültige Erklärung zu dem zugrundeliegenden Mechanismus der Spannungsabhängigkeit von GPCRs beschrieben worden. Mittlerweile wurden unterschiedliche Gruppen von GPCRs auf ihre Spanungsabhängigkeit untersucht. Eine Gruppe mit einer weiten Verbreitung im menschlichen Körper, über die vor dieser Studie noch wenig unter diesem Aspekt bekannt war, ist die Gruppe der Prostanoid-Rezeptoren. Der Startpunkt für diese Studie war eine Untersuchung an Megakaryozyten die eine Aktivierung endogener Thromboxan-Rezeptoren (TP-Rezeptoren) in Anwesenheit eines Agonisten bei Depolarisation nahe legte (Martinez-Pinna et al., 2005). Aufgrund der fehlenden Linearität der angewandten Messung von Calciumspiegeln zur Rezeptor-Aktivität, konnte weder eine qualitative noch eine quantitative Untersuchung des Spannungseffektes erfolgen. Wir verwendeten in dieser Arbeit FRET-Biosensoren, die direkter die TP-Rezeptor-Aktivität wiedergaben und somit eine Charakterisierung des Spannungseffektes ermöglichten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine FRET-basierter TP-Rezeptor-Konformations-Sensor kloniert. Die eigentliche Untersuchung der Spannungsabhängigkeit erfolgte mit einer Kombination aus FRET-Messung als Maß für die Rezeptor-Aktivität und gleichzeitiger Patch-Clamp Messung zur Kontrolle der Membranspannung. Hierbei zeigte sich eine robuste Spannungsabhängigkeit des TP-Rezeptors sowohl auf Rezeptorebene, als auch auf Ebene der nachgeschalteten Signalübertragung. Die TP-Rezeptor-Aktivität verdoppelte sich bei Depolarisation von -90 mV auf +60 mV in Gegenwart von U46619, einem stabilen Analogon von Prostaglandin H2. Der für den TP-Rezeptor ermittelte halbmaximale Spannungseffekt V0,5 betrug 46 mV, was innerhalb des physiologischen Bereichs von VM lag. Weiterhin konnten wir zeigen, dass Spannungseffekt sich im Wesentlichen auf die Affinität des TP-Rezeptor für U46619 auswirkte. So konnten wir unter anderem beobachten, dass der EC50 für U46619 bei -90 mV im Vergleich zu +60 mV ungefähr 4,5-fach links verschoben war und das gleiche Maximum aufwies. Wir haben den Spannungseffekt auf den TP-Rezeptor, aktiviert mit verschieden substituierten Prostanoid-Derivaten, die jeweils Modifikationen an verschiedenen Stellen des Moleküls trugen, getestet. Alle getesteten Liganden zeigten eine Aktivierung bei Depolarisation, was auf eine eher globale Änderung der TP-Rezeptor-Konformation durch Depolarisation hindeutet. Dazu passen unser Befund, dass keine von uns durchgeführten Mutationen, an Stellen die für die Ligandenbindung des TP-Rezeptors wichtig waren, zu einer Änderung Spannungsabhängigkeit des TP-Rezeptors führten. Folglich ergaben sich keine Hinweise auf eine spezifische Modulation der Rezeptor Liganden Interaktion durch Spannungsänderung. Weiterhin konnten wir zeigen, dass der Bereich und die Stärke der Spannungsabhängigkeit durch R2957.40, eine Aminosäure, die sich in Agonistenbindetasche befand, eingeschränkt wurde. Die Modulation der Liganden-induzierten Rezeptor-Aktivität durch VM war nicht auf den TP-Rezeptor beschränkt, da der mit U46619 aktivierte Prostaglandin F-Rezeptor (FP-Rezeptor) und der mit Iloprost aktivierte Prostaglandin E2-Rezeptor-Subtyp 3 (EP3-Rezeptor) eine ähnliche Reaktion auf die Depolarisation zeigten wie der mit U46619 aktivierte TP-Rezeptor. IP-Rezeptor aktiviert mit Iloprost zeigte hingegen keine nachweisbare Spannungsabhängigkeit. Der Unterschied in der Spannungsabhängigkeit konnte nicht auf einzelne unterschiedlich geladene Aminosäuren zurückgeführt werden, weshalb ein komplexerer Unterschied als Grund für die unterschiedliche Spannungsabhängigkeit anzunehmen ist. Im Rahmen dieser Studie wurde auch der PAR1 mit dem besonders sensitiven Gα13-p115-FRET-Interaktions-Assay untersucht, wobei sich herausstellte, dass der PAR1 aktiviert mit Thrombin keinen Spannungseffekt aufwies. Auf der Suche nach einer Liganden-spezifischen Spannungsabhängigkeit wurde Daltroban, ein TP-Rezeptor Antagonist, für den es Hinweise auf einen Partialagonismus gab, untersucht. Es zeigte sich zu unserem Erstaunen, dass Daltroban in hohen Konzentrationen vom Antagonisten zum Partialagonisten wurde, der den TP-Rezeptor transient aktivierte. Aufgrund dieses bemerkenswerten Befundes wurde der beobachtete Daltroban Effekt weiter untersucht. Hierbei zeigte sich, dass der TP-Rezeptor nach Daltroban-Gabe eine reduzierte Aktivierbarkeit aufwies, wobei unklar blieb, ob Daltroban (pseudo )irreversibel am Rezeptor band. Für den partialagonistischen Effekt spielten Kontakte von Daltroban mit der orthosterischen Bindestelle eine Rolle. Zur Untersuchung der Struktur-Wirkungsbeziehung von Daltroban, wurden verschiedene Daltroban-Derivate getestet. Der zugrundeliegende Mechanismus blieb unklar und wird Gegenstand zukünftiger Forschung sein. Weiterhin wurden in dieser Arbeit eine systematische Herangehensweise entwickelt, um FRET-basierte GPCR-Rezeptor-Sensoren zu klonieren, da diese für zukünftige direkte Untersuchungen der Qualität und Quantität des Spannungseffektes auf die Liganden-induzierte GPCR-Aktivität von großem Wert sein können. So wurden in dieser Arbeit erfolgreich FRET-basierte GPCR-Rezeptor-Sensoren für IP-Rezeptor, FP-Rezeptor und ETB-Rezeptor kloniert

Rekrutierung der G-Protein-gekoppelten Rezeptorkinase 2 zum M3-ACh-Rezeptor – Identifizierung des Einflusses von Gαq und Erstellung eines kinetischen Modells

Die G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinase 2 (GRK2) ist eine Serin/Threonin-Kinase mit bedeutender Funktion bei der Desensibilisierung G-Protein-gekoppelter Rezeptoren. Die agonistabhängige Rekrutierung der GRK2 zu aktivierten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren durch Interaktion mit freien Gβγ-Untereinheiten und negativ geladenen Phospholipiden der Membran wurde bereits detailliert erforscht (Pitcher et al., 1992; Touhara et al., 1995). Auch Gαq war als Interaktionspartner der GRK2 bekannt (Carman et al., 1999b). Die GRK2 kann damit auch als Effektor der G-Proteine angesehen werden, der eine phosphorylierungs-unabhängige Desensibilisierung der Rezeptoren durch Sequestrierung aktiver Gq-Protein-Untereinheiten bewirkt. Bisher war allerdings wenig darüber bekannt, ob und welche weiteren Funktionen die Interaktion von Gαq und GRK2 in Bezug auf die Signalweiterleitung Gq Protein-gekoppelter Rezeptoren besitzt. Darüber hinaus fehlte die detaillierte kinetische Beschreibung der agonistabhängigen Rekrutierung der GRK2 zu aktivierten Gq-Protein-gekoppelten Rezeptoren, sowie der Dissoziation des Komplexes nach Auswaschen des Agonisten. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Dynamik der Interaktion der GRK2 mit Gq Protein-gekoppelten Rezeptoren und anderer an der Rekrutierung der GRK2 beteiligter Interaktionen am Beispiel des M3-Acetylcholin (ACh) Rezeptors aufzuklären. Außerdem wurde in diesem Zusammenhang der Einfluss der Gαq-Bindung an die GRK2 untersucht. Dazu wurden neue Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (FRET)-basierte Experimente etabliert, mit deren Hilfe die Interaktion der GRK2 mit M3-ACh-Rezeptoren sowie mit Gαq und Gβγ mit hoher zeitlicher Auflösung in einzelnen lebenden HEK293T-Zellen sichtbar gemacht werden konnte. Die Stimulation der M3-ACh-Rezeptoren mit Acetylcholin führte zu deutlichen FRET-Änderungen, welche die Interaktion der jeweiligen Partner widerspiegelten. Zur Untersuchung des Einflusses der Bindung der Gq-Protein-Untereinheiten an die GRK2 wurden GRK2-Mutanten eingesetzt, die eine reduzierte Bindeaffinität zu Gαq oder Gβγ aufweisen. Die Funktion von Gβγ bei der Membrantranslokation der GRK2, die bisher nur über Endpunktmessungen beschrieben wurde, konnte in dieser Arbeit durch den Einsatz der FRET-Mikroskopie und anderer fluoreszenzmikroskopischer Methoden bestätigt und darüber hinaus erstmals dynamisch vermessen werden. Zusätzlich ergaben die Experimente, dass nicht nur Gβγ, sondern auch Gαq in der Lage ist, die GRK2 agonistabhängig an die Membran zu rekrutieren. Dies stellt einen neuen Aspekt in der Membrantranslokation der GRK2 dar. Ein Vergleich der absoluten FRET-Amplituden der unterschiedlichen GRK2-Mutanten zeigte, dass Gαq zudem das Ausmaß und die Stabilität der Interaktion zwischen GRK2 und dem M3 ACh-Rezeptor erhöht. Funktionelle Untersuchungen zur Kinaseaktivität der GRK2 konnten außerdem nachweisen, dass die Bindung von Gβγ an GRK2 zwar notwendige Bedingung für die Phosphorylierung des Rezeptors ist, eine effiziente Rezeptor-phosphorylierung aber nur bei gleichzeitiger Bindung von Gβγ und Gαq an die GRK2 möglich ist. Diese Ergebnisse belegten die wichtige Funktion von Gαq bei der Rekrutierung der GRK2 zum M3 ACh-Rezeptor, auch wenn Gβγ bei der Rekrutierung der GRK2 die größere Rolle spielt. Allerdings bewies die höhere Sensitivität der GRK2-Gαq-Interaktion gegenüber der Interaktion zwischen GRK2 und Gβγ, dass die GRK2 eine höhere Bindeaffinität zu Gαq als zu Gβγ besitzt. Die Bedeutung von Gαq bei der Rekrutierung der GRK2 zum Rezeptor wird deshalb bei niedrigen Agonist-Konzentrationen vermutlich verhältnismäßig wichtiger sein. Ein Effekt aktivierter Gαq-Untereinheiten auf die Rekrutierung von GRK2 zu Gi-Protein-gekoppelten Rezeptoren konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht beobachtet werden, so dass der Einfluss von Gαq sehr wahrscheinlich auf Gq Protein-gekoppelte Rezeptoren beschränkt ist. Die durchgeführten FRET-Experimente ermöglichten erstmals die detaillierte kinetische Beschreibung der Rekrutierung der GRK2 zum Rezeptor, beginnend bei der Interaktion inaktiver G-Proteine mit aktiven M3-ACh-Rezeptoren bis hin zur Bildung eines Komplexes aus GRK2, Gαq, Gβγ und Rezeptor. Es zeigte sich, dass die Interaktion der GRK2 mit Gβγ etwa 3-mal schneller war als die Gαq Bindung. Die Membrantranslokation der GRK2 durch die Gq-Protein-Bindung ist dabei der geschwindigkeitsbestimmende Schritt für die Interaktion der GRK2 mit dem Rezeptor. Die, in Anwesenheit von Gαq, lang anhaltende Interaktion der GRK2 mit dem M3-ACh-Rezeptor lieferte einen Hinweis darauf, dass die Signalweiterleitung des Rezeptors bereits durch die Bindung der GRK2 gehemmt wird, und nicht erst durch die Rekrutierung von Arrestin, wie bisher vermutet. Zusammenfassend konnte im Rahmen dieser Arbeit zum ersten Mal die wichtige Rolle von Gαq bei der Rekrutierung der GRK2 zum M3 ACh-Rezeptor beschrieben werden, die entscheidenden Einfluss auf die Signalweiterleitung und Desensibilisierung Gq-Protein-gekoppelter Rezeptoren ausübt. Darüber hinaus konnte die kinetische Beschreibung der beteiligten Vorgänge erstmals den zeitlichen Ablauf dieses physiologisch wichtigen Signalwegs entschlüsseln

Untersuchungen zur selektiven Erkennung von G-Proteinen durch GPCRs und ihrer nachgeschalteten Aktivierung mittels Mutagenesestudien

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden mit ca. 800 verschiedenen Individuen die größte Rezeptorgruppe des menschlichen Genoms und sind die Zielstruktur von ca. 30% aller zugelassenen Medikamente. Sie binden vielfältige extrazelluläre Liganden, wie z.B. Neurotransmitter oder Hormone, um Signale ins Zellinnere weiterzuleiten, ohne dass die Liganden selbst die Zellmembran überwinden müssen. Je nachdem an welche der vier verschiedenen Klassen heterotrimerer G-Proteine GPCRs intrazellulär koppeln, werden spezifische physiologische Vorgänge in einer Zelle ausgelöst. Daher ist das Verständnis des Mechanismus der selektiven G-Protein-Erkennung und Kopplung durch GPCRs von zentraler Bedeutung. Kürzlich veröffentlichte Strukturen von GPCR-G-Protein-Komplexen haben das Wissen, wie GPCRs mit G-Proteinen interagieren, zwar deutlich erweitert, jedoch sind sie nur Momentaufnahmen, die nicht die zeitliche Abfolge des mehrstufigen Kopplungsprozesses abbilden können. Außerdem konnten sie keine spezifischen Interaktionsstellen zwischen GPCRs und bestimmten Gα-Unterfamilien enthüllen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden daher FRET-Experimente in lebenden Zellen durchgeführt, um die Subtyp-spezifischen Eigenschaften vielfältiger Gq- und Go-basierter Gα-Chimären zu untersuchen, die für die selektive Bindung und Aktivierung durch M3- (M3R) und H1-Rezeptoren (H1R) verantwortlich sind. Dazu wurden die relativen Bindungsstabilitäten von Gα-Chimären an Rezeptoren in permeabilisierten Zellen bestimmt, indem die Dissoziationskinetiken der Gα-Chimären vom M3R und H1R unter Nukleotid-freien Bedingungen miteinander verglichen wurden. Außerdem wurden die Aktivierungspotenzen der Gα-Chimären in lebenden Zellen durch Auswerten von Konzentrations-Wirkungskurven analysiert, die letztlich die für die Signalweiterleitung relevante Kopplungseffizienz widerspiegeln. Für beide Rezeptoren konnten wir zeigen, dass sowohl die Bindungs- als auch die Aktivierungscharakteristiken von dafür essenziellen Gα-Strukturen, wie dem αN/β1-Loop, dem β2/β3-Loop und der α5-Helix, von einer G-Protein-Klasse auf eine andere übertragen werden konnten. Diese Strukturen unterschieden sich außerdem in ihren Auswirkungen auf die selektive Bindung und die nachfolgende Aktivierung, je nachdem welcher Rezeptor beteiligt war. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden zusätzlich strukturelle Elemente im Rezeptor hinsichtlich ihres Einflusses auf die Kopplungsselektivität untersucht. Erste Versuche, die Kopplungseigenschaften vom M3R gegenüber Gq- oder Go-Proteinen durch Punktmutationen grundlegend zu verändern, waren jedoch nicht erfolgreich. Deshalb wurde der ganze dritte intrazelluläre Loop (ICL3) des M3Rs herausgeschnitten, jedoch hatte dies ebenfalls keine Auswirkungen auf die Bindungsstabilität von Gq- und Go-Proteinen. Wurde im Gegensatz dazu aber der ICL3 des M3Rs mit dem des verwandten, aber ausschließlich Gi/o-koppelnden M2Rs ersetzt (M3ICL3M2), erhöhte sich die Stabilität der Bindung von Gαo. Zuletzt wurde die Bedeutung der Helix 8 für die Selektivität der G-Protein-Kopplung untersucht, indem weitere Chimären zwischen M3R und M2R kloniert wurden. Das führte bei der M3R-basierten M3H8M2-Chimäre zu einem kompletten Kopplungsverlust gegenüber Gαo, obwohl der M2R mit derselben Helix 8 problemlos an Gi/o-Proteine binden kann. Im Einklang mit diesem Ergebnis war die Bindungsstabilität von Gαo an der umgekehrten M2H8M3-Chimäre deutlich erhöht und sogar die Kopplung von Gq wurde trotz des M2R-Grundgerüstes ermöglicht. Insgesamt bietet diese Arbeit neuartige Einblicke in die molekularen Grundlagen der Kopplungsselektivität zwischen verschiedenen Rezeptoren und G-Proteinen