Effect of Clostridium perfringens antigens and acid retinoic on IgA expression in the intestinal mucosa of newborn alpacas (Vicugna pacos)

El objetivo del estudio fue comparar los niveles de expresión relativa del gen del exón 1 de la IgA en el epitelio intestinal de las crías de alpacas tratadas y no tratadas con antígenos de Clostridium perfringens más ácido holotransretinoico (ATRA) por vía oral. Se muestrearon 32 animales: 14 tratados (6 de 1 día de edad y 8 entre 7 a 14 días de edad) y 18 no tratados (10 de 1 día de edad y 8 entre 7 a 14 días de edad). Los animales fueron sacrificados a la semana del tratamiento, se recolectó un segmento de 2 cm de yeyuno y se almacenó a -196 °C. De cada muestra se realizó la extracción de ARN total con el método de TRIzol® y luego se realizó la técnica del RT PCR a tiempo real empleando oligonucleótidos diseñados para la detección del exón 1 del gen de inmunoglobulina A (IgA) de alpaca. La cuantificación de la expresión relativa mediante normalización con ARNm del gen GAPDH y los cálculos de la expresión relativa se realizaron utilizando el método Ct comparativo (2-ΔΔCt). Los resultados indicaron que la administración de antígenos de C. perfringens y ATRA ejerce un efecto inmunomodulador positivo sobre la expresión de IgA en mucosa intestinal de crías de alpacas tratadas. Los animales tratados de ambos grupos etarios presentaron mayor producción de ARNm de IgA en relación a los animales controles (p<0.05).The aim of this study was to compare the relative expression levels of the gene from exon 1 of the IgA in the intestinal epithelium of baby alpacas untreated and treated orally with Clostridium perfringens antigens and all-trans retinoic acid (ATRA). Thirty two animals were sampled: 14 treated (6 of 1 day old and 8 between 7-14 days old) and 18 untreated (10 of 1 day old and 8 between 7-14 days old). The animals were slaughtered after one week of the treatment and 2 cm of the jejunum was collected and kept at -196 °C. Total RNA was extracted from each sample using the TRIzol® method and complementary DNA (cDNA) was synthesized. PCR and RT-PCR Real Time were conducted using specific oligonucleotides designed for the detection of exon 1 of the region Fc IgA in the alpaca. The quantification of the relative expression by normalization with GAPDH gene mRNA and the relative expression calculations were performed using the comparative Ct method (2-ΔΔCt). The results showed that the administration of C. perfringens antigens and ATRA exerts positive immunomodulatory effect of IgA on the intestinal mucosa of treated baby alpacas. Animals of both age groups showed higher IgA mRNA production with respect the non-treated animals (p<0.05)

SEROPREVALENCE OF BOVINE VIRAL DIARRHEA VIRUS IN GRAZING CATTLE IN CAJAMARCA, PERU

El objetivo del presente estudio fue determinar la seroprevalencia del virus de la Diarrea Viral Bovina (VDVB) en bovinos criollos de crianza extensiva, sin historia de vacunación, en la provincia de San Pablo, Cajamarca. Se emplearon 385 muestras del banco de sueros, colectadas en el 2004. Las muestras se estratificaron en cuatro grupos etarios (2 a <6, 6 a <12, 12 a <24 y >24 meses) y por sexo. La detección de anticuerpos contra el VDVB se hizo mediante la prueba de neutralización viral. El 27.1 ± 4.4% (104/385) de los bovinos presentó anticuerpos contra el VDVB indistintamente del grupo etario o sexo; sin embargo, el 71.2 ± 8.7% (47/66) de los animales entre 12 y 24 meses de edad presentaron títulos de anticuerpos entre 128 a >256. Se concluye que el VDVB está presente con una prevalencia baja en la población de bovinos de la provincia de San Pablo.The aim of this study was to determine the seroprevalence of Bovine Viral Diarrheavirus (BVDV) in grazing cattle without history of vaccination, in the province of SanPablo, Cajamarca, Peru. It was used 385 samples from the serum bank, collected in 2004.Samples were stratified in four age groups (2 to <6, 6 to <12, 12 to <24, and >24 months)and by sex. The detection of antibodies against BVDV was done by the viral neutralizationtest. The 27.0 ± 4.4% (104/385) of samples had antibodies against BVDV, and withoutstatistical difference due to age or sex; however, 71.2 ± 8.7% (47/66) of animals between 12 and 24 months of age showed antibody titres between 128 and >256. It was concludedthat the BVDV is present with a low seroprevalence in the cattle population of San Pabloprovince, Cajamarca

Isolation and molecular detection of emerging porcine epidemic diarrhea virus strains in Lima, Peru

En 2013 se observaron cuadros clínicos sugerentes a PEDv en granjas porcinas de Lima y Arequipa llegando hasta el 100% de mortalidad en lechones y con resultados negativos a otros agentes virales como peste porcina clásica (PPCv) y gastroenteritis transmisible (TGEv). Por esta razón, el objetivo del trabajo fue aislar y detectar molecularmente cepas del PEDv en granjas porcinas de Lima. Se colectaron 37 muestras de heces y contenido intestinal de lechones entre 2 y 21 días de edad con cuadros clínicos sugerentes a PEDV procedentes granjas porcinas del departamento de Lima, Perú. El 94.3% (35/37) resultaron positivos al test de inmunocromatografía (IHC). El 97.1% (34/35) de estos fueron confirmados por RT-PCR en tiempo real que amplifica un segmento de 101 pb del gen ORF3 del PEDv. El control y las muestras positivas mostraron un ciclo umbral (Ct) entre 10 y 21 ciclos con una temperatura de disociación (Tm) de 77.7 °C. No hubo amplificación de TGEv ni PPCv utilizados como controles negativos. Todas las muestras positivas fueron procesadas para el aislamiento en la línea celular VERO-21 suplementado con 20 μg/ml tripsina. El 23.5% (8/34) de las células mostraron formas redondeadas y lisis en el cultivo celular entre el primer y segundo pasaje; sin embargo, solo la mitad (4/8) fueron confirmadas por RT-PCR en tiempo real. Este trabajo representa el primer aislamiento del PEDv en el Perú utilizando IHC y confirmado por RT-PCR en tiempo real.In 2013, clinically suggestive cases of PEDv were reported in pig farms in Lima and Arequipa, reaching up to 100% mortality in piglets and negative results to other viral agents such as classical swine fever (CPPv) and transmissible gastroenteritis (TGEv). For this reason, the aim of this study was to isolate and molecularly detect PEDv strains in Lima pig farms. A total of 37 stool samples and intestinal contents of piglets between 2 and 21 days of age with clinical signs suggestive of PEDv from pig farms of the department of Lima, Peru were collected. Results showed that 94.3% (35/37) were positive by the immunochromatography (IHC) test; 97.1% (34/35) of them were confirmed by RT-PCR real-time that amplified a 101-bp segment of the ORF3 gene of the PEDv. The control and positive samples showed a threshold cycle (Ct) between 10 and 21 cycles with a melting temperature (Tm) of 77.7 °C. There was no amplification of TGEv or PPCv used as negative controls. All positive samples were processed for isolation in the VERO-21 cell line supplemented with 20 μg/ml trypsin. The 23.5% (8/34) of the inoculated cells showed rounded shapes and lysis in cell culture between the first and second passage; however, only half (4/8) were confirmed by RT-PCR real-time. This work represents the first isolation of PEDv in Peru using IHC and confirmed by RT-PCR real-time

AISLAMIENTO Y GENOTIPIFICACIÓN DEL VIRUS DEL SÍNDROME RESPIRATORIO Y REPRODUCTIVO PORCINO (VPRRS) EN GRANJAS SEROPOSITIVAS DE LAS PROVINCIAS DE LIMA Y AREQUIPA, PERÚ

The aim of this study was to isolate and genotyping the Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus (PRRSV) strain in pig farms in Lima and Arequipa, Peru. Seropositive pig farms to PRRSV were identified by ELISA test. Blood samples were collected from weaned pigs from positive pig farms in Lima (A=44, B=20; C=16) and Arequipa (D=32, E=92). The serum samples (n=204) were processed in 51 pools of 4 samples each for virus isolation using Porcine Alveolar Macrophage (PAM) cell line. The genome of the virus isolated was identified by Reverse Transcription-nested Polimerase Chain Reaction (RT-nPCR). The complementary DNA (cDNA) of genotype 1 and 2 of PRRSV vaccine strains were used as positive controls and cDNA of equine viral arteritis virus, classical swine fever virus and PAM cells as negative controls in the RT-nPCR. Three blind passages in PAM cell line with each of the 51 pool were done before searching PRRSV antigen by Immunofluorescence test. The 19.6% (10/51) of samples were positive to viral antigen by IF. The 70% (7/10) of the isolated strains had no cytopathic effect. Eight out of ten positive samples were confirmed as PRRSV using RT-nPCR test and 1 of the 41 negative samples was positive to PRRSV by RT-nPCR. The 17.6% (9/51) of isolated were positives to PRRSV using primers that recognize the common genomic sequence to genotype 1 and 2 of PRRSV. All the PRRSV strains confirmed by RT-nPCR test belonged to genotype 1. This is the first evidence of genotype 1-European of PRRSV in pig farms in Peru.El objetivo del presente estudio fue aislar e identificar el genotipo de las cepas del virus del Síndrome Respiratorio y Reproductivo Porcino (VPRRS) de granjas porcinas de las provincias de Lima y Arequipa. Se identificaron granjas porcinas seropositivas al VPRRS mediante la prueba de ELISA. Se colectaron muestras de suero de porcinos en etapa de recría, engorde y acabado de tres granjas de Lima (A=44, B=20, C=16) y dos de Arequipa (D=32, E=92) en 2010. Las 204 muestras fueron procesadas en 51 mezclas de 4 muestras cada una, respetando el lugar de procedencia, para el aislamiento viral en el clon 3D4/31 de la línea celular de macrófago alveolar porcino (PAM). La identificación del genoma viral se realizó mediante la técnica de Transcripción Reversa Reacción en Cadena de la Polimerasa tipo anidada (RT-nPCR). El ADN complementario (ADNc) de cepas vacunales del VPRRS del genotipo 1 y 2 fueron utilizados como controles positivos y ADNc de los virus de la arteritis viral equina y peste porcina clásica y de las células PAM como controles negativos en la técnica de RT-nPCR. Se realizaron tres pasajes ciegos en la línea celular PAM con las 51 mezclas de suero antes de ser procesadas para la búsqueda de antígeno del VPRRS mediante la técnica de inmunofluorescencia directa (IF). El 19.6% (10/51) de las muestras de suero resultaron positivas al aislamiento viral por IF. El 70% (7/10) de las cepas aisladas no presentaron efecto citopático. De los 10 aislados positivos, 8 fueron confirmados como VPRRS por la técnica de RT-nPCR y 1 de las 41 mezclas negativas por IFD fue positiva al VPRRS por RT-nPCR. El 17.6% (9/51) de las muestras resultaron positivos al VPRRS utilizando los cebadores que reconocen a la secuencia génica común al genotipo 1 y 2 del VPRRS. Todas las cepas del VPRRS confirmadas por la técnica de RT-nPCR pertenecieron al genotipo 1. No hubo amplificación del ARN de los controles negativos. Esta es la primera evidencia del genotipo 1 del VPRRS en granjas porcinas en el Perú

Expresión de Citocinas Pro-Inflamatorias de Leucocitos de Alpaca (Vicugna pacos) Inducidos por el Extracto de Macroquistes de Sarcocystis aucheniae

The aim of this research was to determine the expression of proinflammatory cytokines from alpaca leukocytes through the antigenic challenge with macrocyst extract of Sarcocystis aucheniae at various doses and exposure times. Leukocytes in a concentration of 500 000 cells/ml were exposed to concentrations of 0.5, 1, 50, 500 and 1000 ng of macrocyst extract ofS. aucheniae and incubated for 1, 12 and 24 h. The total messenger RNA (mRNA) was extracted for each treatment using Trizol and used to perform real-time RT-PCR with specific primers for cytokine TNF-α and interleukins IL-1α, IL-1β and IL-6. The generated mRNA levels of IL-1α and TNF-α at 1 h were detectable and higher in comparison to the calibrator (leukocytes not exposed to the extract). IL-1β increased at the 1 ng/ml concentration at 24 h showing a negative kinetic expression when compared with the untreated control group. IL-6 was not evidenced by RT-PCR real time. In addition, the leukocytes viability at 1, 12 and 24 h corroborated the toxic effect of the macrocyst extract ofS. aucheniae at high concentrations.El objetivo del trabajo fue determinar la expresión de citocinas pro-inflamatorias de leucocitos de alpaca mediante el enfrentamiento antigénico de extracto de macroquistes de Sarcocystis aucheniae a diversas dosis y tiempos de exposición. Se empleó una concentración de leucocitos de 500 000/ml expuestos a 0.5, 1, 50, 500 y 1000 ng de extracto de macroquistes de S. aucheniae e incubados por 1, 12 y 24 h. Se extrajo los ARN mensajeros (ARNm) totales de cada tratamiento con Trizol y se utilizaron en una RT-PCR tiempo real con cebadores específicos de la citosina TNF-α e interleucinas IL-1α, IL-1β e IL-6. Se observó que los niveles de ARNm de IL-1α y TNF-α generados a 1 h de incubación eran detectables y comparativamente elevados con respecto al calibrador (leucocitos no expuestos a extracto). La IL-1β se encontró incrementada en la concentración de 1 ng/ml a las 24 h, mostrando una cinética de expresión negativa en comparación con el control no tratado. La IL-6 no se evidenció mediante RT-PCR tiempo real. Asimismo, se realizó la observación de viabilidad leucocitaria a los tiempos de 1, 12 y 24 h permitiendo corroborar el efecto tóxico del extracto de macroquistes de S. aucheniae a altas concentraciones

KINETICS OF ANTIBODIES AGAINST PRRSV IN WEANING, FATTENING AND FINISHING PIGS IN A FARM IN LIMA, PERU

El objetivo del presente estudio fue determinar la cinética de anticuerpos contra el virus del Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (VPRRS) en 30 animales de un lote de 200 de una granja porcina tecnificada de Lima. Se recolectaron muestras de sangre en tres periodos consecutivos a los 32, 61 y 136 días de edad para la determinación de anticuerpos contra el VPRRS mediante la prueba de ELISA indirecta. Adicionalmente, el lote de los 200 animales, incluidos los 30 animales experimentales, fue observado diariamente durante el tiempo que duró el estudio en busca de problemas respiratorios. El 26.7% (8/30) de las muestras de los lechones a los 32 días de edad tuvieron anticuerpos contra el VPRRS, así como una sola muestra a los 61 días de edad, mientras que el 96.7% (29/30) a los 136 días de edad presentaron anticuerpos contra el VPRRS con valores M/P entre 0.4 a 2.0. Durante el periodo de observación in situ de los animales del lote no se observaron signos respiratorios anómalos. Se encontró asociación significativa (p<0.05) entre la presencia de anticuerpos y la edad de los animales.The objective of the present study was to evaluate the kinetic of antibodies againstthe Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) in 30 of a group of200 pigs in a commercial farm in Lima, Peru. Blood samples were collected at 32, 61 and 135days of age for detecting antibodies against PRRSV by indirect ELISA. In addition, the occurrence of respiratory clinical signs was daily recorded in the total group of 200animals including the 30 animals of the study. The 26.7% (8/30) of pigs had antibodiesagainst PRRSV at 32 days of age and only one at 61 days of age, while 96.7% (29/30) hadantibodies against PRRSV at 136 days of age with S/P values between 0.4 and 2.0. Nonrespiratory problems were recorded. The presence of antibodies and age of animals wasstatistically associated (p<0.05)

Seroprevalencia del Virus de la Rinoneumonitis en Caballos (Equus caballus) del Perú

The aim of this study was to determine the seroprevalence of antibodies against Equine Herpes Virus type 1 (EHV-1) and Equine Herpes Virus type 4 (EHV-4), which causes rhinopneumonitis in horses. Blood samples (n=825) from Peruvian horses older than six months of age, both sexes, identified as racehorses, Peruvian Paso, equitation and criollo, in apparent healthy conditions, were collected for detection of neutralizing antibodies against EHV-1/EHV-4 by virus neutralization test. The 48.9 ± 5.3% (403/825) of the samples had antibodies against EHV-1/EHV-4. Antibody titers ranged from 2 to >256, where 58.5% ranged from 2 to 8, 29.5% from 16 to 64, and 11.9% from 128 to >256. The sex and region of the country did not represent a risk for presenting antibodies against EHV-1/EHV-4.El objetivo del presente estudio fue determinar la seroprevalencia del virus Herpes Equino tipo 1 o Herpes Equino tipo 4 (VHE-1/VHE-4), causante de la rinoneumonitis viral en caballos. Se recolectaron muestras de suero (n=825) de caballos mayores a seis meses de edad, entre machos y hembras, identificados como caballos de crianza familiar, de carrera, Peruano de Paso y de equitación, clínicamente normales, provenientes de varias regiones del Perú, para la detección de anticuerpos neutralizantes contra el VHE-1/VHE- 4 mediante la prueba de neutralización viral. El 48.9 ± 5.3% (403/825) de las muestras tuvieron anticuerpos contra el VHE-1/VHE-4. Los títulos de anticuerpos tuvieron un rango entre 2 a >256, siendo de 58.6% de títulos de 2 a 8, de 29.5% en títulos de 16 a 64, y de 11.9% en títulos de 128 a >256. La prueba de regresión logística indicó que las variables sexo y lugar de procedencia no constituyeron factores de riesgo para la presentación de anticuerpos contra el VHE-1/VHE-4

ANTIBODIES AGAINST VESICULAR ESTOMATITIS VIRUS IN WHITE-LIPPED PECCARIES (TAYASSU PECARI) IN MADRE DE DIOS, PERU

El objetivo del presente estudio fue determinar la presencia de anticuerpos neutralizantes contra los serotipos New Jersey (NJ) e Indiana subtipo 1 (IND-1) del virus Estomatitis Vesicular (VEV) en huanganas (Tayassu pecari) de vida libre de las localidades de Boca de Manu (n=30), Concesión para la Conservación Los Amigos (n=10) y La Reserva Nacional Tambopata/Parque Nacional Bahuaja Sonene (n=48) en el departamento de Madre de Dios. La presencia de anticuerpos contra el VEV fue determinado mediante la prueba de neutralización viral en las 88 muestras de suero de huanganas machos y hembras adultos de apariencia normal. El 53.4% (47/88) y 18.2% (16/88) de las muestras fue positiva a anticuerpos contra los serotipos IND-1 y NJ, respectivamente, en tanto que el 29.5 y el 2.3% de las muestras tuvieron anticuerpos neutralizantes igual o mayor a 1:32 contra los serotipos IND-1 y NJ, respectivamente. No hubo asociación significativa entre las variables presencia de anticuerpos contra el VEV y lugar de procedencia de las muestras.The aim of the study was to determine the presence of antibodies against New Jersey (NJ) and Indiana subtype 1 (IND-1) Vesicular Stomatitis Virus (VSV) in free-living white-lipped peccaries (Tayassu pecari) in three localities of Madre de Dios, Peru. The presence of antibodies against VSV by virus neutralization test was determined in 88 serum samples of adult male and females in apparent good health condition. Results showed that 53.4% (47/88) and 18.2% (16/88) of samples were positive to antibodies against serotypes IND-1 and NJ respectively, whereas 55.3 and 12.6% of the serum samples had neutralizing antibodies titers equal or greater than 1:32 against serotype IND-1 and NJ respectively. There was a no significant association between seropositivity of VSV and source of samples

EVALUACIÓN in vitro DE LA RESPUESTA LEUCOCITARIA DE ALPACAS (Vicugna pacos) EN PRESENCIA DE ANTÍGENOS CLOSTRIDIALES

The aim of this study was to evaluate the expression of proinflammatory cytokines of alpaca circulating leukocytes when confronting total extract of Clostridum perfringens (structural components and toxins). Whole blood was collected from the jugular vein of 5 female and 5 male adult alpacas. The leukocytes were separated using ammonium chloride to lyse erythrocytes followed by centrifugation and then cultured at a concentration of 500 000 cells/ml of MEM (Minimal Essential Medium) in culture plates of 12 wells. Simultaneously were challenged with total extract of C. perfringens grown in thioglycolate broth at concentrations of 400, 80, 16, 0.8 and 0.2 μg/ml and then quantifying by RT-PCR the expression of cytokines TNF∝, IL-1∝, IL-6 and IL-1ß at 1, 12 and 24 h of exposure. The results showed that low doses of clostridial extracts (0.2 to 0.8 mg/ml) are capable of inducing expression of TNF∝, IL-1∝ and IL-1ß at 1, 12 and 24 h of incubation, whereas higher doses do not exceed the expression of cytokines in unstimulated (control) leukocytes. There was no significant production of IL-6 up to 24 h after exposure to whole extract of C. perfringens. These results indicate that C. perfringens and its toxins at low doses induce activation of circulatory leukocyte in alpacas producing proinflammatory cytokine secretion.El objetivo del presente estudio fue evaluar la expresión de citoquinas proinflamatorias de leucocitos circulantes de alpaca al enfrentarlos a extracto total de Clostidium perfringens (componentes estructurales y toxinas). Se colectó sangre entera de la vena yugular de 5 alpacas hembras y 5 alpacas machos adultos. Los leucocitos fueron separados utilizando cloruro de amonio para lisar los eritrocitos, seguido de centrifugación y luego cultivados a una concentración de 500 000 leucocitos/ml de medio MEM (Medio Mínimo Esencial) en placas de cultivo de 12 pocillos. Simultáneamente, fueron enfrentados a extracto total de C. perfringens cultivados en caldo tioglicolato a concentraciones de 400, 80, 16, 0.8 y 0.2 μg/ml, para luego cuantificar, mediante la RTPCR, la expresión de las citoquinas TNF∝, IL-1∝, IL-1ß e IL-6 a 1, 12 y 24 h de exposición. Los resultados demostraron que dosis bajas de extractos clostridiales (0.2 a 0.8 μg/ml) son capaces de inducir expresiones de TNF∝, IL-1∝, e IL-1ß a 1, 12 y 24 h de incubación, a diferencia de dosis altas donde no sobrepasan la expresión de las citoquinas en leucocitos no estimulados (control). No se evidencia producción considerable de IL-6 hasta las 24 h post exposición a extracto completo de C. perfringens. Los resultados indican que el C. perfringens y sus toxinas a dosis bajas inducen la activación de los leucocitos circulantes de alpacas produciendo la secreción de citoquinas proinflamatorias

Identificación Hematológica y Molecular de Anaplasma platys en Caninos Domésticos de Lima Metropolitana con Signos Clínicos Compatibles con Anaplasmosis

This study aimed to determine the presence ofAnaplasma platys in domestic dogs of Metropolitan Lima with clinic signs consistent with anaplasmosis by identifying inclusion bodies in platelets and through the Hemi-Nested PCR technique using peripheral blood samples. For this purpose, 144 samples were collected between January to December 2012. The results showed that 29.2% (42/144) were positive (thrombocytopenic individuals and presence ofinclusion bodies in platelets) and 12.5% (18/144) were suspicious (nonthrombocytopenic individuals and presence of inclusion bodies in platelets) by hematologic identification. Moreover, 1.4% (2/144) resulted positive to the Hemi-Nested PCR test. These results confirm the presence ofA. platys in domestic dogs in the countryEl presente estudio tuvo como objetivo determinar la presencia de Anaplasma platys en caninos domésticos de Lima Metropolitana con signos clínicos compatibles con anaplasmosis, mediante la identificación de corpúsculos de inclusión en plaquetas y a través de la técnica Hemi-Nested PCR en muestras de sangre periférica. Se recolectaron 144 muestras de sangre entre enero y diciembre de 2012. De estas, el 29.2% (42/144) fue positiva (individuos trombocitopénicos con presencia de corpúsculos de inclusión en plaquetas) y el 12.5% (18/144) resultó sospechoso (individuos no trombocitopénicos y presencia de corpúsculos de inclusión en plaquetas) a la identificación hematológica. Asimismo, 1.4% (2/144) resultó positivo a la prueba de Hemi-Nested PCR. Estos hallazgos confirman la presencia de A. platys en caninos domésticos en el país