STAT3 and TP53 mutations associate with poor prognosis in anaplastic large cell lymphoma

Funder: European Union’s Horizon 2020 Marie Skłodowska – Curie Innovative Training Networks (ITN - ETN) under grant agreement No.: 675712European Union’s Horizon 2020 Marie Skłodowska – Curie Innovative Training Networks (ITN - ETN) under grant agreement No.: 675712 Czech Science Foundation (GA CR), junior project no. 19-23424Y MEYS CZ project CEITEC 2020 (LQ1601)Funder: MEYS CZ project CEITEC 2020 (LQ1601) NCMG research infrastructure (LM22018132 funded by MEYS CR)Funder: European Union’s Horizon 2020 Marie Skłodowska – Curie Innovative Training Networks (ITN - ETN) under grant agreement No.: 675712.Funder: MH CZ-RVO 6526970

Molecular analysis of extranodal NK/T-cell lymphoma, nasal type in Latin America

Das extranodale natürliche Killer/T-Zell-Lymphom (NK/T) vom nasalen Typ (ENKTCL) ist ein hoch aggressives Lymphom, das mit einer EBV-Infektion einhergeht und in der asiatischen und lateinamerikanischen Bevölkerung sehr häufig vorkommt und charakteristische klinisch-pathologische Merkmale auf-weist. Mehrere Studien in asiatischen HNO-Kohorten haben die häufigsten rekurrenten somatischen Mutationen in STAT3, STAT5B, JAK3, DDX3X, TP53, MGA, MSN und BCOR identifiziert. Allerdings ist das Spektrum genetischer Veränderungen bei ENKTCL unvollständig beschrieben und der Mutationssta-tus von ENKTCL Patienten in Lateinamerika noch nicht untersucht worden. Das Hauptziel dieser Studie war es, das Spektrum an Mutationen in einer Ko-horte von ENKTCL-Fällen aus Lateinamerika (Mexiko, Peru und Argentinien) zu untersuchen, sie mit einer asiatischen Kohorte zu vergleichen und sowohl den EBV-Typ als auch den LMP1-Genstatus zu untersuchen. Dafür wurden 71 Fälle von ENKTCL aus 3 verschiedenen Zentren in Lateinamerika analysiert. HE-Färbung, CD56 und EBER-in-situ-Hybridisierung wurden durchgeführt, um die Diagnose zu bestätigen und den Tumorgehalt zu bestimmen. Die Sequen-zierung der in asiatischen ENKTCL am häufigsten mutierten Gene wurde mit-tels NGS mit Hilfe eines selbst zusammengestellten AmpliSeq-Panels durch-geführt. Darüber hinaus wurden der EBV-Typ und die LMP1-Deletion von 30 bp mittels PCR untersucht. Am häufigsten fanden sich Mutationen, die den JAK-STAT-Signalweg beeinflussen, gefolgt von MSN (10 Fälle, 14%). STAT3 war das am häufigsten mutierte Gen (16 Fälle, 22%), während andere Mitglie-der des JAK-STAT-Signalwegs, STAT5B (ein Fall) und JAK3 (2 Fälle), selten identifiziert wurden. Alle STAT3-Mutationen waren aktivierende Mutationen, die sich innerhalb der SH2-Domäne befinden und zur pSTAT3-Expression führten. Inaktivierende Mutationen in BCOR und DDX3X wurden ebenfalls in 9 (13%) bzw. 6 (8,5%) Fällen gefunden. TP53-Mutationen wurden nur in 6 Fäl-len (8,5%) identifiziert. Interessanterweise schlossen sich Mutationen in STAT3, BCOR und DDX3X gegenseitig aus, was auf eine Schlüsselrolle der JAK-STAT, NOTCH und Zellzyklus-Signalwege hinweist. Typ-A-EBV mit dem Wildtyp-LMP1-Gen (53/71; 75%) war der häufigste Genotyp, während EBV Typ-B mit LMP1-Deletion nur in 3 mexikanischen Fällen nachgewiesen wurde. ENKTCL in Lateinamerika weisen häufig STAT3-aktivierende Mutationen auf. Darüber hinaus war das EBV vom Typ A mit LMP1-Wildtyp der häufigste Stamm, der in dieser Kohorte gefunden wurde. Keine dieser Variablen beein-flusste jedoch das Gesamtüberleben. Außerdem war das ENKTCL-Mutationsspektrum Lateinamerikas mit der asiatischen Kohorte vergleichbar.Extranodal NK/T-cell lymphoma (ENKTCL) nasal type, is an aggressive lym-phoma associated with EBV infection, highly prevalent in Asian and Latin American populations with characteristic clinicopathological features. Several studies in Asian ENKTCL cohorts have identified the most common recurrent somatic mutations in STAT3, STAT5B, JAK3, DDX3X, TP53, MGA, MSN and BCOR; however, the genomic landscape in the ENKTCL is still incomplete and the mutation status in cases from Latin America remains to be investigated. The main objective of this study was to investigate the mutation landscape in a cohort of ENKTCL cases from Latin America (Mexico, Peru and Argentina), to compare it with Asian cohorts and to investigate EBV strain type and LMP1 gene status. We analyzed 71 cases of ENKTCL from 3 different centers in Lat-in America. Hematoxylin staining (H&E), CD56 and EBER in situ hybridization were performed to confirm the diagnosis and calculate the tumor content in all cases. Sequencing of the most frequently mutated genes was performed using NGS workflow based on a custom AmpliSeq panel. In addition, EBV strain type classification and LMP1 deletion at 30 bp was carried out by PCR. Mutations affecting the JAK-STAT pathway were the most frequent mutation anomaly fol-lowed by MSN (10 cases, 14%). STAT3 was the most frequently mutated gene (16 cases, 22%), while other members of the JAK-STAT pathway, STAT5B (one case) and JAK3 (2 cases), were rarely identified. All STAT3 mutations were activating mutations, located within the SH2 domain, leading to expres-sion of pSTAT3 evidenced by immunohistochemistry. Inactivating mutations in BCOR and DDX3X were found in 9 (13%) and 6 (8.5%) cases, respectively. TP53 mutations were identified in only 6 cases (8.5%). Interestingly, mutations in STAT3, BCOR and DDX3X were mutually exclusive, indicating the key role of JAK-STAT, NOTCH and cell cycle signaling pathways. EBV type A with the wild-type LMP1 gene (53/71; 75%) was the most common genotype in all cas-es, while EBV type B with LMP1 deletion was detected only in 3 Mexican cas-es. The ENKTCL mutation status in Latin America showed frequent STAT3-activating mutations. Furthermore, EBV type A with LMP1 wild-type was the most common strain found in this cohort. However, none of these variables affected overall survival. Finally, the ENKTCL mutation landscape of Latin America was comparable to that of Asian cohorts

The role of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) and CEBPβ-regulated miRNAs in ALK+ Anaplastic Large Cell Lymphoma

ALK+ und ALK- anaplastische großzellige Lymphome (ALCL) weisen unterschiedliche miRNA-Signaturen auf, einschließlich einer niedrigen Expression von miR-146a, miR-181a und miR-26a bei ALK+ALCL. In dieser Studie wurden die nachgeschalteten Zielgene dieser Tumorsuppressor-miRNAs in ALK+ ALCL durch Transkriptomanalyse untersucht, und CD147, GLUT3 und CD93 wurden als ihre potenziellen Ziele identifiziert. Ihre unterschiedliche Expression bei ALK+ ALCL im Vergleich zu ALK- ALCL und normalen T-Zellen deutet darauf hin, dass diese Gene eine Rolle bei der Pathogenese dieses Lymphoms spielen, insbesondere bei der Regulierung des Stoffwechsels und der Angiogenese. In dieser Arbeit haben wir die Zielgen-Achse ALK-miR-146a-CD147 genauer untersucht und CD147 als direktes Ziel der miR-146 bestätigt. Weitere Studien in vitro und in vivo in einem Xenograft-Mausmodell bestätigten, dass CD147 zum Überleben und zur Proliferation von ALK+ ALCL beiträgt. Knockdown (KD) und Knockout (KO) von CD147 führten zu einer metabolischen Umprogrammierung, einem verringerten Glukoseverbrauch, einer Verlangsamung des Tumorwachstums und mitochondrialen Schäden. Metabolomics in Zelllinien und Tumoren, denen CD147 fehlte, unterstützten diese Ergebnisse, indem sie eine Stoffwechselverschiebung durch verringerte aerobe Glykolyse und erhöhte Basalatmung aufzeigten, letztere als Kopplungsmechanismus aufgrund mitochondrialer Schäden. Zusammenfassend deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass ALK-regulierte Tumorsuppressoren miRNAs eine wichtige Rolle bei der ALCL-Onkogenese spielen. Insbesondere miR-146a erweist sich als entscheidend für die Regulierung von CD147, einem Onkogen, das einen veränderten Stoffwechsel fördert, um den Energiebedarf der ALCL-Zellen für das Tumorwachstum zu decken. Darüber hinaus birgt der ALK-miR-146a-CD147-Signalweg ein großes Potenzial als neuartiges Therapieziel bei diesem Lymphom und muss weiter untersucht werden.The miRNA signature including miR-146a, miR-181a, and miR-26a is differentially expressed in ALK+ and ALK-anaplastic large cell lymphoma (ALCL). In this study, the downstream target genes of these tumor suppressor miRNAs in ALK+ ALCL were investigated by transcriptome analysis, and CD147, GLUT3, and CD93 were identified as their potential targets. Based on their differential expression in ALK+ ALCL compared with ALK- ALCL and normal T cells, these genes revealed to have a role in the pathogenesis of this lymphoma, by regulating metabolism and angiogenesis. In this thesis, we investigated the ALK-miR-146a-CD147 target gene axis in more detail, confirming CD147 as a direct target of miR-146. Further studies in vitro and in vivo in a xenograft mouse model confirmed that CD147 contributes to ALK+ ALCL survival and proliferation. Knockdown (KD) and knockout (KO) of CD147 resulted in metabolic reprogramming, decreased glucose consumption, retardation of tumor growth, and mitochondrial damage. Metabolomics in CD147-silenced cell lines and tumors revealed a metabolic shift by reducing aerobic glycolysis and increasing basal respiration, the latter as a coupling mechanism due to mitochondrial damage. In summary, our results suggest that ALK-regulated tumor suppressors miRNAs play an important role in ALCL oncogenesis. In particular, miR-146a appears to be essential for the regulation of CD147, an oncogene that promotes altered metabolism to meet the energy requirements of ALCL cells for tumor growth. Moreover, the ALK-miR-146a-CD147 pathway holds great potential as a novel target therapy in this lymphoma and requires further investigation