Tipping the balance both ways: drug resistance and virulence in Candida glabrata

Among existing fungal pathogens, Candida glabrata is outstanding in its capacity to rapidly develop resistance to currently used antifungal agents. Resistance to the class of azoles, which are still widely used agents, varies in proportion (from 5 to 20%) depending on geographical area. Moreover, resistance to the class of echinocandins, which was introduced in the late 1990s, is rising in several institutions. The recent emergence of isolates with acquired resistance to both classes of agents is a major concern since alternative therapeutic options are scarce. Although considered less pathogenic than C. albicans, C. glabrata has still evolved specific virulence traits enabling its survival and propagation in colonized and infected hosts. Development of drug resistance is usually associated with fitness costs, and this notion is documented across several microbial species. Interestingly, azole resistance in C. glabrata has revealed the opposite. Experimental models of infection showed enhanced virulence of azole-resistant isolates. Moreover, azole resistance could be associated with specific changes in adherence properties to epithelial cells or innate immunity cells (macrophages), both of which contribute to virulence changes. Here we will summarize the current knowledge on C. glabrata drug resistance and also discuss the consequences of drug resistance acquisition on the balance between C. glabrata and its host

Gene Responses to Oxygen Availability in Kluyveromyces lactis: an Insight on the Evolution of the Oxygen-Responding System in Yeast

The whole-genome duplication (WGD) may provide a basis for the emergence of the very characteristic life style of Saccharomyces cerevisiae—its fermentation-oriented physiology and its capacity of growing in anaerobiosis. Indeed, we found an over-representation of oxygen-responding genes in the ohnologs of S. cerevisiae. Many of these duplicated genes are present as aerobic/hypoxic(anaerobic) pairs and form a specialized system responding to changing oxygen availability. HYP2/ANB1 and COX5A/COX5B are such gene pairs, and their unique orthologs in the ‘non-WGD’ Kluyveromyces lactis genome behaved like the aerobic versions of S. cerevisiae. ROX1 encodes a major oxygen-responding regulator in S. cerevisiae. The synteny, structural features and molecular function of putative KlROX1 were shown to be different from that of ROX1. The transition from the K. lactis-type ROX1 to the S. cerevisiae-type ROX1 could link up with the development of anaerobes in the yeast evolution. Bioinformatics and stochastic analyses of the Rox1p-binding site (YYYATTGTTCTC) in the upstream sequences of the S. cerevisiae Rox1p-mediated genes and of the K. lactis orthologs also indicated that K. lactis lacks the specific gene system responding to oxygen limiting environment, which is present in the ‘post-WGD’ genome of S. cerevisiae. These data suggested that the oxygen-responding system was born for the specialized physiology of S. cerevisiae

Genomic Exploration of the Hemiascomycetous Yeasts: 1. A set of yeast species for molecular evolution studies11Sequences and annotations are accessible at: Génoscope (http://www.genoscope.cns.fr), FEBS Letters Website (http://www.elsevier.nl/febs/show/), Bordeaux (http://cbi.genopole-bordeaux.fr/Genolevures) and were deposited into the EMBL database (accession number from AL392203 to AL441602).

AbstractThe identification of molecular evolutionary mechanisms in eukaryotes is approached by a comparative genomics study of a homogeneous group of species classified as Hemiascomycetes. This group includes Saccharomyces cerevisiae, the first eukaryotic genome entirely sequenced, back in 1996. A random sequencing analysis has been performed on 13 different species sharing a small genome size and a low frequency of introns. Detailed information is provided in the 20 following papers. Additional tables available on websites describe the ca. 20 000 newly identified genes. This wealth of data, so far unique among eukaryotes, allowed us to examine the conservation of chromosome maps, to identify the ‘yeast-specific’ genes, and to review the distribution of gene families into functional classes. This project conducted by a network of seven French laboratories has been designated ‘Génolevures’

Genomic Exploration of the Hemiascomycetous Yeasts: 19. Ascomycetes-specific genes

AbstractComparisons of the 6213 predicted Saccharomyces cerevisiae open reading frame (ORF) products with sequences from organisms of other biological phyla differentiate genes commonly conserved in evolution from ‘maverick’ genes which have no homologue in phyla other than the Ascomycetes. We show that a majority of the ‘maverick’ genes have homologues among other yeast species and thus define a set of 1892 genes that, from sequence comparisons, appear ‘Ascomycetes-specific’. We estimate, retrospectively, that the S. cerevisiae genome contains 5651 actual protein-coding genes, 50 of which were identified for the first time in this work, and that the present public databases contain 612 predicted ORFs that are not real genes. Interestingly, the sequences of the ‘Ascomycetes-specific’ genes tend to diverge more rapidly in evolution than that of other genes. Half of the ‘Ascomycetes-specific’ genes are functionally characterized in S. cerevisiae, and a few functional categories are over-represented in them

ETUDE DE FHL1P. UN REGULATEUR TRANSCRIPTIONNEL DE LA FAMILLE FORK HEAD CHEZ LA LEVURE SACCHAROMYCES CEREVISIAE

ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Etude du complexe II de la chaîne respiratoire de la levure Saccharomyces cerevisiae et du nematode Caenorhabditis elegans (étude des pathologies humaines affectant le complexe II)

Les causes génétiques des déficits du complexe II (CII) de la chaîne respiratoire (SDH ou SQR) sont encore mal compris. En plus de l identification de nouvelles mutations chez les patients, deux modèles animaux, S.cerevisiae et C.elegans, seront utilisés. Chez S.cerevisiae, l absence de chaque gène de SDH engendre l incapacité à respirer. Le test de complémentation fonctionnelle d une souche délétée pour SDH1 par le gène HsSDHA ne restaure pas le métabolisme respiratoire. De nouveaux gènes impliqués dans le fonctionnement du CII sont cherchés par tests d activité enzymatique ou de résistance aux inhibiteurs du complexe II sur mutants. Chez C.elegans, l inactivation de chaque gène montre un phénotype embryonnaire létal ou un retard de développement. Le profil biochimique de ces mutants transitoires prouve la relation entre inactivation des gènes sdh-2, sdh-3 /mev-1 et sdh-4, et diminution d activité enzymatique du CII. Trois gènes étaient initialement suspectés pour coder la sous-unité SDH-1 : seuls deux gènes coderaient en réalité pour cette sous-unité (sdh-1 et sdh-5). Le profil d expression de SDH-1::GFP semble toxique à haute dose mais montre une spécificité d expression tissulaire. Au vu de ces résultats et dans le but d élaborer notre test de complémentation par des allèles HsSDHA, un mutant de délétion pour sdh-1 a été obtenu et est en cours d étude : il montre un phénotype létal. Enfin, le séquençage des 4 gènes de structure de la SDH pour 18 patients ne montre pas de mutation. Pour deux de ces enfants, une région d haplo-identité en 12p13, susceptible de contenir le gène de la maladie, a été trouvée et quelques gènes candidats ont été séquencés et exclus.Mutations causing respiratory chain complex II (CII) deficiency are still partly unknown. This work focuses on the identification of novel mutations or genes implicated in CII deficiency in the yeast S.cerevisiae, the worm C.elegans, or human patients. In S.cerevisiae, absence of SDH genes leads to respiration incapacity. Functional complementation by the human gene SDHA in a deleted yeast strain does not save the respiratory phenotype. Enzymatic activity or CII inhibitors resistance assays are investigated among S.cerevisiae CII mutants, in order to identify novel genes linked to CII function. In C.elegans, RNAi of each SDH putative gene leads to embryonic lethality or delay in development. CII activity measurement on these worms shows that sdh-2, sdh-3 /mev-1 and sdh-4 are really CII genes. Three genes are supposed to encode subunit SDH-1 but we functionally demonstrated that only sdh-1 and sdh-5 code for this subunit. SDH-1::GFP construct seems to by toxic when overexpressed in wild type worms, but harbours a specific spatio-temporal expression pattern. A sdh-1 deletion strain has been investigated: the deletion, clearly identified, is homozygous lethal. Such a strain can now be transfected by sdh-1 or human SDHA in order to perform functional complementation in the nematode. In human, a cohort of 18 patients showing CII disorders has also been sequenced for the 4 SDH encoding genes, and no mutation has been found. Two sisters of this cohort have been further investigated: a region of 5 Mb in 12p13 contain the gene causing the CII deficiency. Some genes in this region have been sequenced and exhibit no mutation till now.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

ETUDE COMPARATIVE DU FACTEUR DE TRANSCRIPTION MULTIMERIQUE HAP2/3/4/5P CHEZ LES LEVURES SACCHAROMYCES CEREVISIAE ET KLUYVEROMYCES LACTIS (CARACTERISATION DES DOMAINES FONCTIONNELS DE LA SOUS-UNITE REGULATRICE SCHAP4P)

PARIS-AgroParisTech Centre Paris (751052302) / SudocSudocFranceF

Structural and functional evolution of the HAP4 gene (the key regulator of the fermentation/respiration balance in the yeast Saccharomyces cerevisiae)

Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, le complexe transcriptionel HAP est impliqué dans la balance respiration/fermentation. Ce complexe est composé de 4 sous unités. 3 sous unités sont nécessaires pour le fixation du complexe à l'ADN alors que la sous unité Hap4p est la clef dans la régulation du passage fermentation-respiration chez S. cerevisiae. Jusqu'à présent, aucun homologue de HAP4 n'avait été identifié excepté chez K. lactis. L'examen des 2 séquences de Hap4 a conduit à l'identification de 2 séquences peptidiques très courtes, identifiées aussi chez d'autres levures. Chez la levure Hansenula polymorpha, 2 homologues putatifs de la protéines Hap4 ont été identifiés, constitués de la séquence N- terminale de la protéine Hap4 de S. cerevisiae ainsi que d'un motif de type b-Zip qui est spécifique de la famille de protéine YAP, mais uniquement pour le second homologue. Grâces aux outils génétiques et moléculaires ainsi qu'à la connaissance de la séquence génomique de cette levure, nous avons exprimés ces protéines chez S. cerevisiae et montré d'une part qu'elles sont capables de restaurer un défaut de croissance dans une souche délétée pour hap4 et d'autre par que le deuxième homologue confère une résistance au H2O2 dans un mutant yap1 de S. cerevisiae. De nombreuses expériences ont été réalisées afin de confirmer la similarité et la diversité fonctionnelle de ces nouveaux gènes par rapport à ScHAP4. La découverte des protéines régulatrices Hap4 chez H. polymorpha qui comportent uniquement la partie N-terminale de ScHap4 ainsi que le domaine b-Zip spécifique de la famille des protéines YAP, indique que ces domaines jouent un rôle crucial dans l'évolution.In Saccaromyces cerevisiae, the HAP transcriptional complex is involved in the fermentation-respiration shift. This complex is composed of 4 subunits. Three subunits are necessary for DNA binding, whereas the Hap4p subunit, glucose-repressed, is the key regulator of the fermentation/respiration balance in yeast S. cerevisiae. Up to date no HAP4 homolog has been identified except for Kluyveromyces lactis. Examination of these two HAP4 sequences leads to the identification of two very short conserved peptides also identified in other yeasts. For the Hansenula polymorpha yeast, two possible HAP4 homologues have been found with only the N-terminal conserved domain of the S. cerevisiae Hap4 protein for the both homologues and an additional short motif of the b-Zip type which is specific for the family of the YAP proteins for the second one. Since molecular genetic tools exist and complete genome sequence is known for this yeast, we have expressed these putative HpHap4 proteins in S. cerevisiae and shown that both of these protein are able to restore the growth defect of the S. cerevisiae hap4 deleted strain and the second one confers H2O2 resistance to S. cerevisiae yap1 mutant. A set of experiments was performed to confirm the functional similarity and diversity of these new genes with ScHAP4. The discovery of Hap4-regulatory proteins in H. polymorpha with only the N-terminal conserved domain of the S. cerevisiae Hap4 protein and domain of b-Zip type specific for the family of the YAP proteins, indicates that these domains may play a crucial role during evolution.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

CONSTRUCTION D'UNE BANQUE DE FUSIONS TRADUCTIONNELLES ET SON UTILISATION POUR L'EXPLORATION MOLECULAIRE ET FONCTIONNELLE DU GENOME DE KLUYVEROMYCES LACTIS

KLUYVEROMYCES LACTIS EST UNE LEVURE NON CONVENTIONNELLE APPARENTEE A S. CEREVISIAE. ELLE A ETE UTILISEE POUR LA PRODUCTION DE PROTEINES HETEROLOGUES D'INTERET ALIMENTAIRE ET MEDICAL GRACE A SON SYSTEME SECRETOIRE EFFICACE. CEPENDANT CETTE LEVURE RESTE MAL CONNUE AUX NIVEAUX GENETIQUE ET MOLECULAIRE. POUR CONTRIBUER AU DEVELOPPEMENT DE K. LACTIS COMME ORGANISME EUCARYOTE DE CHOIX POUR LA PRODUCTION HETEROLOGUE, NOUS AVONS CONSTRUIT UNE BANQUE DE FUSIONS TRADUCTIONNELLES QUI NOUS A PERMIS DE : - GENERER DES ETIQUETTES DE GENES CONNUES SOUS LE NOM D'ESTS (POUR EXPRESSED SEQUENCED TAGS) A PARTIR D'UN ECHANTILLON ALEATOIRE. L'ANALYSE DE CES ESTS ET LA COMPARAISON DES SEQUENCES PEPTIDIQUES CORRESPONDANTES AVEC LEURS HOMOLOGUES DE S. CEREVISIAE NOUS A PERMIS DE CONCLURE QUE LA MOYENNE D'IDENTITE DES SEQUENCES PEPTIDIQUES DE K. LACTIS ET DE S.CEREVISIAE EST IMPORTANTE (57% AVEC UNE DEVIATION STANDARD DE 17%). CETTE INFORMATION SUPPLEMENTAIRE CONFORTE LA PARENTE PHYLOGENETIQUE ENTRE K. LACTIS ET S.CEREVISIAE DETERMINEE A PARTIR DES SEQUENCES D'ADN RIBOSOMIQUE. DE PLUS LA CLASSIFICATION DES SEQUENCES PEPTIDIQUES DEDUITES DE NOS ESTS EN CATEGORIES FONCTIONNELLES (DETERMINEES POUR S.CEREVISIAE) A PERMIS DE CONCLURE QUE LES DIFFRENTES CLASSES FONCTIONNELLES SONT CONSERVEES ENTRE K.LACTIS ET S.CEREVISIAE. - MONTRER QUE LA SELECTION GENETIQUE DE TOUTES LES FUSIONS EXPRIMEES DE LA BANQUE NE PEUT PAS SE FAIRE SI ON TRANSFORME UNE SOUCHE DE K.LACTIS INCAPABLE DE CROITRE SUR LACTOSE (DELETEE POUR LE GENE LAC4 SPECIFIANT LA -GALACTOSIDASE DE K. LACTIS) AVEC LA BANQUE DE FUSIONS AVEC LE GENE LACZ DE E.COLI COMME RAPPORTEUR. L'ETALEMENT ETANT FAIT SUR UN MILIEU MINIMUM CONTENANT LE LACTOSE COMME SEULE SOURCE DE CARBONE. PAR CONTRE, CETTE SELECTION PERMET DE SELECTIONNER DES GENES FORTEMENT EXPRIMES SUSCEPTIBLES D'AVOIR DES PROMOTEURS FORTS QUI POURRAIENT ETRE UTILISES POUR LA PRODUCTION HETEROLOGUE. - MONTER QUE LES SYSTEMES DE DEFENSE DE K.LACTIS CONTRE LES STRESS THERMIQUE ET OXYDATIF SONT PARTIELLEMENT CHEVAUCHANTS AVEC S.CEREVISIAE (CERTAINS GENES SONT REGULES DE LA MEME MANIERE CHEZ LES DEUX ORGANISMES), ALORS QUE D'AUTRES GENES SONT SPECIFIQUEMENT INDUITS CHEZ L'UN OU L'AUTRE DES DEUX ORGANISMES. NOUS AVONS RELIE CES DIFFERENCES DES REPONSES AUX STRESS AUX METABOLISMES ENERGETIQUES DIFFERENTS DE K.LACTIS ET S.CEREVISIAE. CETTE ETUDE DES REPONSES AUX STRESS CHEZ K.LACTIS MET A DISPOSITION DES BIOTECHNOLOGUES DES GENES QUI POSSEDERAIENT DES PROMOTEURS REGULES INTERESSANTS POUR LA PRODUCTION DES DIFFERENTES PROTEINES HETROLOGUES.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF