Xylosyltransferase-I Regulates Glycosaminoglycan Synthesis during the Pathogenic Process of Human Osteoarthritis

Loss of glycosaminoglycan (GAG) chains of proteoglycans (PGs) is an early event of osteoarthritis (OA) resulting in cartilage degradation that has been previously demonstrated in both huma and experimental OA models. However, the mechanism of GAG loss and the role of xylosyltransferase-I (XT-I) that initiates GAG biosynthesis onto PG molecules in the pathogenic process of human OA are unknown. In this study, we have characterized XT-I expression and activity together with GAG synthesis in human OA cartilage obtained from different regions of the same joint, defined as “normal”, “late-stage” or adjacent to “late-stage”. The results showed that GAG synthesis and content increased in cartilage from areas flanking OA lesions compared to cartilage from macroscopically “normal” unaffected regions, while decreased in “late-stage” OA cartilage lesions. This increase in anabolic state was associated with a marked upregulation of XT-I expression and activity in cartilage “next to lesion” while a decrease in the “late-stage” OA cartilage. Importantly, XT-I inhibition by shRNA or forced-expression with a pCMV-XT-I construct correlated with the modulation of GAG anabolism in human cartilage explants. The observation that XT-I gene expression was down-regulated by IL-1β and up-regulated by TGF-β1 indicates that these cytokines may play a role in regulating GAG content in human OA. Noteworthy, expression of IL-1β receptor (IL-1R1) was down-regulated whereas that of TGF-β1 was up-regulated in early OA cartilage. Theses observations may account for upregulation of XT-I and sustained GAG synthesis prior to the development of cartilage lesions during the pathogenic process of OA

Expression de deux isoformes d'UDP-glucuronosyltransferase humaine chez E. coli: activite enzymatique et production d'anticorps

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Régulation de la synthèse des protéoglycanes et du phénotype chondrocytaire par l'interleukine 1 et Wnt-3a (rôle clé de la xylosyltransférase I et du syndécan 4)

L'arthrose est caractérisée par une dégénérescence progressive du cartilage articulaire. Elle est caractérisée par l'augmentation des cytokines pro-inflammatoires en particulier l'interleukine-1ß (IL-1ß) qui inhibe la synthèse des protéoglycanes (PGs) et augmente leur dégradation conduisant à l'érosion du cartilage. Cependant, les mécanismes moléculaires de cette inhibition ne sont pas encore élucidés. Nous avons étudié l'effet de l'IL-1ß sur l'expression du gène de la xylosyltransférase I (XT-I), enzyme qui joue un rôle essentiel dans la régulation de la synthèse des PGs au niveau du cartilage. Nous avons montré que l'IL-1ß est capable de réguler l'expression de la XT-I en deux phases : une phase précoce d'induction et une phase tardive d'inhibition. L'étude de la régulation du promoteur du gène humain de la XT-I par l'IL-1ß a permis de montrer que la phase précoce d'induction est médiée par le facteur AP-1 alors que la phase d'inhibition implique le facteur de transcription Sp3. Nous avons également étudié les mécanismes moléculaires impliqués dans l'inhibition de l'anabolisme des PGs et de l'induction de la dédifférenciation chondrocytaire par Wnt3a. Nous avons montré que Wnt-3a inhibe l'expression du PG, syndécan 4 dans le cartilage et dans les chondrocytes humain en culture via la voie de signalisation non canonique, ERK1/2. Nous avons montré que l'inhibition de l'expression du collagène II par Wnt-3a est médiée par le syndécan 4 et que ce dernier est essentiel à l'activation des voies non canoniques par Wnt-3a probablement via une interaction avec la protéine régulatrice Dishevelled. Enfin, nous avons montré que les effets délétères de l'IL-1ß sur les PGs et le collagène II sont atténués par Wnt-3a en inhibant l'expression de l'ADMTS4 et de la MMP13Osteoarthritis is characterized by progressive degeneration of articular cartilage. It is characterized by the increase in pro-inflammatory cytokines, in particular interleukin 1ß (IL- 1ß ) which inhibits the synthesis of proteoglycans (PGs ) and increases their degradation leading to erosion of cartilage. However, the molecular mechanism of this inhibition is not yet elucidated. We studied the effect of IL-1ß on gene expression of the xylosyltransferase I ( XT- I), an enzyme which plays an essential role in regulating the synthesis of PGs in the cartilage. We showed that IL-1ß regulates the expression of the XT-I gene into two phases: an early phase of induction and a late phase of inhibition. The study of the regulation of the promoter of the human XT-I gene showed that the early induction phase by IL-1ß is mediated by AP-1 while the late inhibition phase involves the Sp3 transcription factor. We also investigated the molecular mechanisms involved in the inhibition of PG anabolism and induction of chondrocyte dedifferentiation by Wnt-3a. We showed that Wnt-3a inhibits expression of the PG syndecan 4 in human cartilage and in cultured chondrocytes via the non-canonical signaling pathway involving the kinase ERK1/2. We also showed that inhibition of the expression of collagen II by Wnt-3a is mediated by syndecan 4, probably via interaction with a regulatory protein Dishevelled and that syndecan 4 is essential for non-canonical Wnt pathway signaling. Finally, we demonstrated that the deleterious effects of IL-1ß on PGs and collagen II are reduced by Wnt-3a by inhibiting the expression of ADMTS4 and MMP13NANCY-INPL-Bib. électronique (545479901) / SudocSudocFranceF

Études structurales et fonctionnelles des UDP-glucuronosyltransférases humaines de la Famille 1A

L UGT1A6 humaine appartient à la famille multigénique des UDP-glucuronosyltransférases (UGTs) qui sont responsables de la biotransformation des xénobiotiques et des substances endogènes. Cette isoforme joue un rôle important en pharmaco-toxicologie car elle est impliquée dans la métabolisation de médicaments et de substances phénoliques polycycliques. L UGT1A6 catalyse le transfert de l acide glucuronique, à partir du substrat donneur l acide UDP-a-D-glucuronique, sur des phénols accepteurs hydrophobes. Le mécanisme réactionnel postulé est de type SN2 et fait appel à une base catalytique capable d activer l accepteur par déprotonation. Il s ensuit une attaque nucléophile sur le carbone 1 de l acide glucuronique et conduit à la formation d un ß-D-glucuronide hydrosoluble avec inversion de configuration et libération d UDP facilitée par la présence d un cation magnésium. Le but de notre travail est d identifier les acides aminés qui sont impliqués dans la catalyse enzymatique et dans la reconnaissance des substrats. Nous avons cherché dans un premier temps la base catalytique. Le rôle des 15 acides aminés aspartique / glutamique hautement conservés de toute la séquence codante de l UGT1A6 humaine a été évalué par mutagenèse dirigée systématique, modification chimique et modélisation par homologie avec les glycosyltransférases dont la structure 3-D est résolue. Nous avons montré que, sauf pour les résidus aspartique Asp150 et Asp488, la substitution des résidus carboxyliques par alanine a conduit à des mutants actifs mais présentant une diminution de l activité enzymatique et une baisse d affinité pour le substrat accepteur et / ou le substrat donneur. En outre, la comparaison de séquences des UGTs et l homologie avec les glycosyltransférases suggèrent que l Asp150 joue un rôle de base catalytique. Dans un second temps, nous avons identifié l acide aminé (His38) de l UGT1A6 comme résidu pivot dans la reconnaissance des substrats accepteurs. L étude a tiré profit de l existence de 2 isoformes présentant 93% d homologie et des spécificités de substrats très différentes : l UGT1A4 qui métabolise que des amines et l UGT1A3 qui métabolise les phénols, acides carboxyliques mais pas les amines. La comparaison de séquences de la famille UGT1A fait apparaître un résidu histidine très conservé dans toute les isoformes, sauf dans l UGT1A4 ou il est remplacé par une proline. La substitution de Pro40 de l UGT1A4 par His élargit l activité enzymatique aux composés phénoliques et carboxyliques (spécificité de type UGT1A3). Inversement, lorsque le résidu His40 de l UGT1A3 est remplacé par la proline, cette isoforme conjugue les amines et pas les phénols et acides carboxyliques, comme l UGT1A4. Cette étude constitue une avancée importante sur la compréhension des mécanismes moléculaires de la glucuronoconjugaison des xénobiotiques et des médicaments. Enfin, dans une dernière partie nous avons entrepris une étude visant à établir la panoplie des UGTs présentes dans les cellules chondrocytaires articulaires chez l homme qui sont la cible de médicaments de type anti-inflammatoires non stéroïdiens carboxyliques et d estrogènes connus pour affecter l homéostasie du cartilage. Les résultats montrent que plusieurs isoformes sont présentes à l état de transcrits, à des niveaux très faibles, ne permettant pas pour l instant de les caractériser par immunodosage ou par mesure de l activité enzymatique.The human UDP-glucuronosyltransferase UGT1A6 is the primary phenol-metabolizing UGT isoform. It catalyzes the nucleophilic attack of phenolic xenobiotics on UDP-glucuronic acid, leading to the formation of water-soluble glucuronides. The catalytic mechanism proposed for this reaction is an acid-base mechanism that involves an aspartic/glutamic acid and/or histidine residue. Here, we investigated the role of fifteen highly conserved aspartic/glutamic acid residues over the entire sequence of human UGT1A6 by site-directed mutagenesis. We showed that, except for aspartic residues D150 and D488, the substitution of carboxylic residues by alanine led to active mutants but with decreased enzyme activity and lower affinity for acceptor and/or donor substrate. Further analysis including mutation of the corresponding residue in other UGT1A isoforms suggests that D150 play a major catalytic role. In this report, we also identified a single active site residue important for glucuronidation of phenols and carboxylic acid substrates by UGT1A enzyme family. Replacing P40 of UGT1A4 by histidine expanded the glucuronidation activity of the enzyme to phenolic and carboxylic compounds, therefore leading to UGT1A3-type isoform in terms of substrate specificity. Conversely, when H40 residue of UGT1A3 was replaced with proline, the substrate specificity shifted toward that of UGT1A4 with loss of glucuronidation of phenolic substrates. Furthermore, mutation of H39 residue of UGT1A1 (H40 in UGT1A4) to proline led to loss of glucuronidation of phenols but not of estrogens. This study provides a step forward to better understand the glucuronidation mechanism and substrates recognition, which is invaluable for a better prediction of drug metabolism and toxicity in human. In the last part of the work, we determined the UGT isoforms that are expressed in human articular chondrocytes, and which are involved in the glucuronidation of nonsteroidal anti-inflammatory drugs and estrogens known to affect cartilage homeostasy. The results showed that several isoforms were indeed expressed as a transcript, but at a very low level, making the characterisation of the enzyme via their activity or immunodosage unsuccessful.NANCY1-Bib. numérique (543959902) / SudocSudocFranceF

L'agrécane et le cartilage articulaire : apport des glycosyltransférases dans la réparation du cartilage arthrosique

L'arthrose, la maladie la plus fréquente du système musculo-squelettique, est la conséquence de processus mécaniques et biologiques qui rompent l'homéostasie du cartilage, de la synoviale et de l'os sous-chondral. Dans le but de développer de nouvelles thérapeutiques efficaces, visant à restaurer la matrice cartilagineuse, nous caractérisons les mécanismes moléculaires et les protéines-clés responsables de l'initiation de la maladie. Un des évènements les plus précoces est la dégradation de l'agrécane qui est le protéoglycane matriciel le plus abondant. Les chaînes de chondroïtine sulfate liées à la protéine porteuse sont découpées en petits fragments. Le laboratoire s'intéresse aux glycosyltransférases qui catalysent la formation des chaînes polysaccharidiques, en particulier celles impliquées dans la synthèse de l'amorce tétrasaccharidique commune de liaison à la protéine porteuse, GlcA$\beta$1,3Galβ1,3Gal$\beta$1,4Xyl-O-Sérine. La galactose β1,3-glucuronosyltransférase-I (GlcAT-I), qui attache l'acide glucuronique terminal et qui est fortement réprimée durant l'arthrose, est une cible potentiellement intéressante. En effet, l'enzyme recombinante humaine joue un rôle primordial dans la synthèse des glycosaminoglycanes (GAG). La surexpression de la GlcAT-I dans des explants de cartilage traités par l'IL1$\beta$ est capable de s'opposer complètement à la déplétion en protéoglycanes provoquées par cette cytokine pro-inflammatoire. Des études structure/fonction/régulation de cette enzyme ont alors été entreprises. Les résultats constituent les bases pour le développement de plusieurs thérapeutiques basées sur la vectorisation de gènes en intra-articulaire et la conception de glycomimétiques capables de réparer le cartilage

Constitutive activation of EGFR is associated with tumor progression and plays a prominent role in malignant phenotype of chondrosarcoma

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