Inhibition of hypoxia inducible factor-1a (HIF-1a) by the circadian factors CRY1/PER1 and induction of tumor progression in the liver by hepatocyte-specific deficiency of manganese superoxide dismutase

Das zelluläre Uhrwerk der circadianen Rhythmik enthält eine autoregulatorische negative Feedbackschleife. Dabei induzieren am Beginn des circadianen Rhythmus die heterodimeren Komplexe aus CLOCK- und BMAL1-Proteinen die Transkription ihrer Zielgene, darunter auch die der Period- (PER) und Cryptochrom- (CRY)-Gene. Am Ende des circadianen Rhythmus inhibieren die CRY- und PER-Proteine die CLOCK/BMAL1-gesteuerte Transkription. Die durch Sauerstoffmangel gesteuerte Regulation der Transkription wird durch die Hypoxie-induzierbaren Faktoren (HIF) reguliert, von denen HIF-1α eine besondere Rolle bei vielen physiologischen und pathophysiologischen Vorgängen spielt. Im Schlaf, d.h. in der circadianen Nachtphase ändert sich die funktionelle Organisation der Atmung grundlegend und es kommt zu einer leichten Reduktion des Sauerstoffpartialdruckes und das Auftreten hypoxischer Perioden wird begünstigt, was auf einen Zusammenhang zwischen circadianer Rhythmik und Hypoxie-gesteuerter Transkription hindeutet. Daher wurde in der vorliegenden Studie untersucht, welchen Einfluss die circadianen Proteine CRY1 und PER1 auf HIF-1α und die HIF-1 regulierte Transkription haben. Es konnte die Interaktion zwischen den circadianen Proteinen CRY1 und PER1 mit HIF-1α erstmalig in lebenden Zellen nachgewiesen werden. Die HIF-1α-Proteinregion in der sich die basic-Helix-Loop-Helix-(bHLH)-Domäne befindet und die C-terminale tail-Region des CRY1-Proteins konnten als verantwortliche Proteindomänen für die Interaktion zwischen CRY1 und HIF-1α identifiziert werden. Die Interaktion von HIF-1α mit PER1 erfolgte ebenso über die bHLH Domäne des HIF-1α-Proteins. Die CRY1-HIF-1α-Interaktion beeinflusste die transkriptionelle Aktivität von HIF-1α negativ und verringerte die Expression von HIF-1-Targetgenen, wie dem Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-1 (PAI-1). Darüberhinaus konnte mit CRY- und PER-defizienten Zellen gezeigt werden, dass CRY1 und PER1 unabhängig von der Interaktion mit HIF-1α auch eine Repression der HIF-1α-mRNA-Expression und der HIF-1α-Promotoraktivität verursachen. Diese Daten zeigen, dass die Regulation der Transkription durch Hypoxie durch die negativen Regulatoren der circadianen Rhythmik beeinflusst werden kann. Diese Befunde könnten somit zum besseren Verständnis bestimmter Krankheiten, wie der Tumorigenese oder dem Schlaf-Apnoe-Syndrom beitragen. Da HIF-1α ein wichtiger Faktor in der Tumorigenese ist, der durch Veränderungen im Redoxzustand der Zellen beeinflusst wird und dabei möglicherweise mitochondriale ROS, die einem circadianen Rhythmus unterliegen, eine wichtige Rolle spielen, wurde untersucht, inwiefern eine Erhöhung der mitochondrialen ROS-Spiegel durch Defizienz der MnSOD tumorprogressiv ist. Die MnSOD wird als eines der wichtigsten intrazellulären antioxidativen Enzyme angesehen und soll eine Rolle als Tumorsuppressor spielen. Mittels Microarraytechnologie wurde die differentielle Genexpression in den Lebern der Hepatozyten-spezifischen MnSOD-defizienten Mäuse untersucht. Es konnte die Repression von vielen Genen gefunden werden, deren Produkte eine wichtige Rolle in der Abwehr gegen oxidativen Stress, der Krebsabwehr und der Hemmung der Apoptose spielen. Auf der anderen Seite konnte die Überexpression vieler Indikatoren für oxidativen Stress festgestellt werden. Desweiteren konnte die Induktion von nur zwei Genen, die eine Rolle in der Abwehr gegen den oxidativen Stress spielen gemessen werden, so dass insgesamt nur ein geringer kompensatorischer Effekt auf die MnSOD-Defizienz erreicht wird. Ein Vergleich der differentiell exprimierten Gene in der Hepatozyten-spezifischen MnSOD-defizienten Maus mit differentiell exprimierten Genen aus unter Hypoxie inkubierten bzw. HIF-1α-dominant-aktiven arteriellen Endothelzellen brachte keine Überschneidungen und zeigt, dass die höheren ROS-Level in den MnSOD-defizienten Hepatozyten die Hypoxie nicht imitieren bzw. nicht zu einer Expression von HIF-1-Targetgenen führen. Die MnSOD-defizienten Lebern waren auch anfälliger für die Entwicklung von hepatozellulären präneoplastischen Läsionen nach Induktion durch eine Einzeldosis Diethylnitrosamin (DEN). Die Anzahl der präneoplastischen Herde und die Bildung von Adenomen war im Vergleich zu den Wildtyptieren bei den Hepatozyten-spezifischen MnSOD-defizienten Tieren signifikant erhöht. Diese Daten zeigten, dass die Entstehung von präneoplastischen Läsionen und Tumoren unter Einwirkung von karzinogenen Substanzen bei den Hepatozyten-spezifischen MnSOD(-/-)-Mäusen mit einer stark erhöhten Rate im Vergleich zu den Wildtyptieren auftritt. Damit konnte die Rolle der MnSOD als Tumorsuppressor zumindest für die Leber bestätigt bzw. direkt aufgezeigt werden

Inhibition of hypoxia inducible factor-1a (HIF-1a) by the circadian factors CRY1/PER1 and induction of tumor progression in the liver by hepatocyte-specific deficiency of manganese superoxide dismutase

Das zelluläre Uhrwerk der circadianen Rhythmik enthält eine autoregulatorische negative Feedbackschleife. Dabei induzieren am Beginn des circadianen Rhythmus die heterodimeren Komplexe aus CLOCK- und BMAL1-Proteinen die Transkription ihrer Zielgene, darunter auch die der Period- (PER) und Cryptochrom- (CRY)-Gene. Am Ende des circadianen Rhythmus inhibieren die CRY- und PER-Proteine die CLOCK/BMAL1-gesteuerte Transkription. Die durch Sauerstoffmangel gesteuerte Regulation der Transkription wird durch die Hypoxie-induzierbaren Faktoren (HIF) reguliert, von denen HIF-1α eine besondere Rolle bei vielen physiologischen und pathophysiologischen Vorgängen spielt. Im Schlaf, d.h. in der circadianen Nachtphase ändert sich die funktionelle Organisation der Atmung grundlegend und es kommt zu einer leichten Reduktion des Sauerstoffpartialdruckes und das Auftreten hypoxischer Perioden wird begünstigt, was auf einen Zusammenhang zwischen circadianer Rhythmik und Hypoxie-gesteuerter Transkription hindeutet. Daher wurde in der vorliegenden Studie untersucht, welchen Einfluss die circadianen Proteine CRY1 und PER1 auf HIF-1α und die HIF-1 regulierte Transkription haben. Es konnte die Interaktion zwischen den circadianen Proteinen CRY1 und PER1 mit HIF-1α erstmalig in lebenden Zellen nachgewiesen werden. Die HIF-1α-Proteinregion in der sich die basic-Helix-Loop-Helix-(bHLH)-Domäne befindet und die C-terminale tail-Region des CRY1-Proteins konnten als verantwortliche Proteindomänen für die Interaktion zwischen CRY1 und HIF-1α identifiziert werden. Die Interaktion von HIF-1α mit PER1 erfolgte ebenso über die bHLH Domäne des HIF-1α-Proteins. Die CRY1-HIF-1α-Interaktion beeinflusste die transkriptionelle Aktivität von HIF-1α negativ und verringerte die Expression von HIF-1-Targetgenen, wie dem Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-1 (PAI-1). Darüberhinaus konnte mit CRY- und PER-defizienten Zellen gezeigt werden, dass CRY1 und PER1 unabhängig von der Interaktion mit HIF-1α auch eine Repression der HIF-1α-mRNA-Expression und der HIF-1α-Promotoraktivität verursachen. Diese Daten zeigen, dass die Regulation der Transkription durch Hypoxie durch die negativen Regulatoren der circadianen Rhythmik beeinflusst werden kann. Diese Befunde könnten somit zum besseren Verständnis bestimmter Krankheiten, wie der Tumorigenese oder dem Schlaf-Apnoe-Syndrom beitragen. Da HIF-1α ein wichtiger Faktor in der Tumorigenese ist, der durch Veränderungen im Redoxzustand der Zellen beeinflusst wird und dabei möglicherweise mitochondriale ROS, die einem circadianen Rhythmus unterliegen, eine wichtige Rolle spielen, wurde untersucht, inwiefern eine Erhöhung der mitochondrialen ROS-Spiegel durch Defizienz der MnSOD tumorprogressiv ist. Die MnSOD wird als eines der wichtigsten intrazellulären antioxidativen Enzyme angesehen und soll eine Rolle als Tumorsuppressor spielen. Mittels Microarraytechnologie wurde die differentielle Genexpression in den Lebern der Hepatozyten-spezifischen MnSOD-defizienten Mäuse untersucht. Es konnte die Repression von vielen Genen gefunden werden, deren Produkte eine wichtige Rolle in der Abwehr gegen oxidativen Stress, der Krebsabwehr und der Hemmung der Apoptose spielen. Auf der anderen Seite konnte die Überexpression vieler Indikatoren für oxidativen Stress festgestellt werden. Desweiteren konnte die Induktion von nur zwei Genen, die eine Rolle in der Abwehr gegen den oxidativen Stress spielen gemessen werden, so dass insgesamt nur ein geringer kompensatorischer Effekt auf die MnSOD-Defizienz erreicht wird. Ein Vergleich der differentiell exprimierten Gene in der Hepatozyten-spezifischen MnSOD-defizienten Maus mit differentiell exprimierten Genen aus unter Hypoxie inkubierten bzw. HIF-1α-dominant-aktiven arteriellen Endothelzellen brachte keine Überschneidungen und zeigt, dass die höheren ROS-Level in den MnSOD-defizienten Hepatozyten die Hypoxie nicht imitieren bzw. nicht zu einer Expression von HIF-1-Targetgenen führen. Die MnSOD-defizienten Lebern waren auch anfälliger für die Entwicklung von hepatozellulären präneoplastischen Läsionen nach Induktion durch eine Einzeldosis Diethylnitrosamin (DEN). Die Anzahl der präneoplastischen Herde und die Bildung von Adenomen war im Vergleich zu den Wildtyptieren bei den Hepatozyten-spezifischen MnSOD-defizienten Tieren signifikant erhöht. Diese Daten zeigten, dass die Entstehung von präneoplastischen Läsionen und Tumoren unter Einwirkung von karzinogenen Substanzen bei den Hepatozyten-spezifischen MnSOD(-/-)-Mäusen mit einer stark erhöhten Rate im Vergleich zu den Wildtyptieren auftritt. Damit konnte die Rolle der MnSOD als Tumorsuppressor zumindest für die Leber bestätigt bzw. direkt aufgezeigt werden

Microarray analysis of expressed sequence tags from haustoria of the rust fungus Uromyces fabae

Rust fungi are plant parasites which colonise host tissue with an intercellular mycelium that forms haustoria within living plant cells. To identify genes expressed during biotrophic growth, EST sequencing was performed with a haustorium-speciWc cDNA library from Uromyces fabae. One thousand seventeen ESTs were generated, which assembled into 530 contigs. Several of the most frequently represented sequences in the EST database were identical to the in planta induced genes (PIGs) identiWed previously (Hahn, M., Mendgen, K., 1997. Characterisation of in planta-induced rust genes isolated from a haustorium-speciWc cDNA library, Mol. Plant Microbe Interact. 10, 427 437). Virus-encoded sequences were identiWed, providing evidence for two novel RNA mycoviruses in U. fabae. Microarray hybridisation revealed many cDNAs that were signiWcantly activated in rust-infected leaves compared to germinated uredospores. Very strong in planta expression was found for two PIGs encoding putative metallothioneins. Furthermore, several genes involved in ribosome biogenesis and translation, glycolysis, amino acid metabolism, stress response, and detoxiWcation showed an increased expression in the parasitic mycelium. These data indicate a strong shift in gene expression in rust fungi between germination and the biotrophic stage of development

Mitochondrial dysfunction due to lack of manganese superoxide dismutase promotes hepatocarcinogenesis

Abstract Aims: One of the cancer hallmarks is mitochondrial dysfunction associated with oxidative stress. Among the first line of defense against oxidative stress is the dismutation of superoxide radicals, which in the mitochondria is carried out by manganese superoxide dismutase (MnSOD). Accordingly, carcinogenesis would be associated with a dysregulation in MnSOD expression. However, the association studies available so far are conflicting, and no direct proof concerning the role of MnSOD as a tumor promoter or suppressor has been provided. Therefore, we investigated the role of MnSOD in carcinogenesis by studying the effect of MnSOD deficiency in cells and in the livers of mice. Results: We found that loss of MnSOD in hepatoma cells contributed to their conversion toward a more malignant phenotype, affecting all cellular properties generally associated with metabolic transformation and tumorigenesis. In vivo, hepatocyte-specific MnSOD-deficient mice showed changed organ architecture, increased expression of tumor markers, and a faster response to carcinogenesis. Moreover, deficiency of MnSOD in both the in vitro and in vivo model reduced β-catenin and hypoxia-inducible factor-1⍺ levels. Innovation: The present study shows for the first time the important correlation between MnSOD presence and the regulation of two major pathways involved in carcinogenesis, the Wnt/β-catenin and hypoxia signaling pathway. Conclusion: Our study points toward a tumor suppressive role of MnSOD in liver, where the Wnt/β-catenin and hypoxia pathway may be crucial elements

The circadian clock protein CRY1 is a negative regulator of HIF-1α

Abstract The circadian clock and the hypoxia-signaling pathway are regulated by an integrated interplay of positive and negative feedback limbs that incorporate energy homeostasis and carcinogenesis. We show that the negative circadian regulator CRY1 is also a negative regulator of hypoxia-inducible factor (HIF). Mechanistically, CRY1 interacts with the basic-helix-loop-helix domain of HIF-1α via its tail region. Subsequently, CRY1 reduces HIF-1α half-life and binding of HIFs to target gene promoters. This appeared to be CRY1 specific because genetic disruption of CRY1, but not CRY2, affected the hypoxia response. Furthermore, CRY1 deficiency could induce cellular HIF levels, proliferation, and migration, which could be reversed by CRISPR/Cas9- or short hairpin RNA-mediated HIF knockout. Altogether, our study provides a mechanistic explanation for genetic association studies linking a disruption of the circadian clock with hypoxia-associated processes such as carcinogenesis