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Digital NFATc2 Activation per Cell Transforms Graded T Cell Receptor Activation into an All-or-None IL-2 Expression
The expression of interleukin-2 (IL-2) is a key event in T helper (Th) lymphocyte activation, controlling both, the expansion and differentiation of effector Th cells as well as the activation of regulatory T cells. We demonstrate that the strength of TCR stimulation is translated into the frequency of memory Th cells expressing IL-2 but not into the amount of IL-2 per cell. This molecular switch decision for IL-2 expression per cell is located downstream of the cytosolic Ca2+ level. Here we show that in a single activated Th cell, NFATc2 activation is digital but NF-ÎșB activation is graded after graded T cell receptor (TCR) signaling. Subsequently, NFATc2 translocates into the nucleus in an all-or-none fashion per cell, transforming the strength of TCR-stimulation into the number of nuclei positive for NFATc2 and IL-2 transcription. Thus, the described NFATc2 switch regulates the number of Th cells actively participating in an immune response
NFATc2 is a switch of t-cell-receptor dependent activation of human CD4+ Th cells
Titelblatt und Inhaltsverzeichnis
AbkĂŒrzungsverzeichnis
Einleitung
Material und Methoden
Ergebnisse
Diskussion
Zusammenfassung
Summary
LiteraturverzeichnisDie IL-2 Expression von CD4+ Th-Zellen nach spezifischer TCR Stimulation ist
ein SchlĂŒsselereignis der adaptiven Immunantwort. Eine Fehlregulation des
Zytokins IL-2 hat fundamentale Auswirkungen auf die Homöostase des adaptiven
Immunsystems in vivo. WĂ€hrend die transkriptionelle Regulation des IL-2
Promotors hinreichend erforscht wurde, sind die zellulÀren
Entscheidungsprozesse der Signaltransduktion, die zur Bildung von IL-2 fĂŒhren,
kaum bekannt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die transkriptionelle
Induktion von IL-2 innerhalb einer peripheren humanen CD4+ Th-Zellpopulation
wÀhrend der initialen mitogenen Th-Zellaktivierung modulierbar war, und einem
binÀren und nicht graduellen Entscheidungsprozess unterlag. Die graduelle
Stimulation oder graduelle Inhibierung der TCR-abhÀngigen Aktivierung von Th-
Zellen resultierte in einer VerÀnderung der Frequenz der IL-2 produzierenden
Zellen und nicht in einer VerÀnderung der IntensitÀt der IL-2 Produktion pro
Zelle. Der Entscheidungsprozess dieser binÀren IL-2 Expression wurde in dieser
Arbeit erstmalig und auf Einzelzellebene untersucht. Hierzu wurden die IL-2
Produzenten und die IL-2 Nichtproduzenten einer humanen CD4+ Th-Zellpopulation
anhand des IL-2 Sekretionsassays separiert. DarĂŒber hinaus wurde eine Methode
zur durchflusszytometrischen Detektion der aktivierten Transkriptionsfaktoren
NFATc2 und NF-kB (p65) in isolierten intakten Zellkernen aus humanen Th-Zellen
etabliert. Mit dieser Arbeit konnte belegt werden, dass NFATc2 als ein
zellulÀrer Schalter der Ca2+/Calcineurin-abhÀngigen T-Zellaktivierung
funktioniert. Die IL-2 Produktion zeigte eine groĂe AbhĂ€ngigkeit von der
intrazellulÀren exprimierten NFATc2 Menge und resultierte infolge eines
binÀren Aktivierungs- und nukleÀren Translokationsprofils von NFATc2 in einem
binÀren IL-2 Expressionsprofil in individuellen Zellen. Im Gegensatz dazu
wurde fĂŒr die Aktivierung von NF-kB (p65) eine graduelles nukleĂ€res
Translokationsprofil detektiert. Durch mathematische Modellierung der
vorliegenden Ergebnisse konnte zudem eine binÀre Geninduktion als Folge einer
Schalteraktivierung von NFATc2 in Reaktion auf eine graduelle Stimulation mit
Ionomycin simuliert werden, fĂŒr die bereits die kooperative Dephosphorylierung
von 7 der 13 Serin-Phosphorylierungsstellen am NFATc2 MolekĂŒl als ausreichend
fĂŒr die Induktion einer binĂ€ren IL-2 Expression ermittelt werden konnte. Damit
kann der hier beschriebene NFATc2 Schalter als ein Ăbersetzer der SignalstĂ€rke
bei der T-Zellaktivierung in die effektive Anzahl an aktivierten,
zytokinproduzierenden Th-Zellen angesehen werden, der als ein allgemeiner
Kontrollpunkt in Th-Zellen die QualitÀt der adaptiven Immunantwort
mitbestimmt.Expression of IL-2 by activated T helper cells is a key event of the adaptive
immune response after antigenic stimulation. The dysregulation of IL-2 is of
fundamental consequence for the homeostasis of the immune system in vivo.
While the molecular analysis of IL-2 trans-criptional regulation has been
extensively studied the cellular decision processes leading to IL-2 expression
are not known. In this study is shown that in human periphal CD4+ Th cells the
transcriptional response of IL-2 can be modulated after initial mitogenic
stimulation and is followed by a binary and not a graded decision process. The
titration of the Ca2+ ionophore ionomycin or inhibition of mitogenic
stimulation by the classical calcineurin inhibitor cyclosporine A only changed
the frequency of IL-2 producing cells but not the intensity of IL-2 production
per cell. The molecular decision process leading to the binary IL-2 expression
pattern shown here was examined for the first time and on individual cells. On
this account, the IL-2 capture assay was used to separate IL-2 producing and
non-producing cells after stimulation. For single cell analysis, a method for
cytometrical detection of the activated transcription factors NFATc2 and NF-kB
(p65) in isolated nuclei was developed. The results proved NFATc2 as a
cellular switch of Ca2+/calcineurin dependent T cell activa-tion. The IL-2
production showed great dependancy on the intracellular level of expressed
NFATc2 and results in binary IL-2 expression pattern after all-or-non
activation of NFATc2 in individual cells. Graded stimulations by titration
with Ionomycin or CsA lead to an all-or-non NFATc2 but graded NF-kB (p65)
nuclear translocation per cell. Mathematical modeling predicts that co-
operativity of at least 7 of the 13 NFATc2 dephosphorylation sites after
graded stimulation by ionomycin would be sufficient to induce a binary IL-2
expression. By translating the strength of antigenic T cell stimulation into
the frequency of cytokine producing Th cells, the described NFATc2 switch is a
general hub for productive adaptive immune response