Study of the differences in the fermentative metabolism of S. cerevisiae, S. uvarum and S. kudriavzevii species

Tesis por compendio[ES] Saccharomyces cerevisiae, además de ser un importante organismo modelo en biología, es indiscutiblemente la especie de levadura más utilizada en procesos fermentativos industriales, incluyendo el sector enológico. Su capacidad de fermentar en concentraciones elevadas de azúcares, tolerar concentraciones altas de etanol y soportar la adición de sulfitos, son algunos de los factores que explican su éxito en fermentaciones vínicas. El metabolismo fermentativo de S. cerevisiae en condiciones enológicas se conoce bien gracias a una amplia bibliografía científica. En cambio, aún se sabe poco sobre el metabolismo de las especies de Saccharomyces criotolerantes, S. uvarum y S. kudriavzevii, quienes han suscitado recientemente el interés del sector vitivinícola por sus buenas propiedades fermentativas a bajas temperaturas, tales como la producción de vinos con mayor contenido en glicerol y alta complejidad aromática, llegando a veces a reducir su contenido en etanol. En este contexto, esta tesis pretende ampliar nuestros conocimientos sobre el metabolismo fermentativo de S. uvarum y S. kudriavzevii en condiciones enológicas, profundizando en el entendimiento de las diferencias existentes con el de S. cerevisiae, así como entre cepas de S. cerevisiae de distintos orígenes. Para ello, hemos utilizado varias técnicas ómicas para analizar la dinámica de los metabolomas (intra- y extracelulares) y/o transcriptomas de cepas representativas de S. cerevisiae, S. uvarum y S. kudriavzevii a alta (25 °C) y baja (12 °C) temperatura de fermentación. También, hemos desarrollado un modelo metabólico a escala de genoma que, junto a un análisis de balance de flujos, es capaz de cuantificar los flujos a través del metabolismo del carbono y del nitrógeno de levaduras en cultivo de tipo batch. Así, el conjunto de estos trabajos nos ha permitido identificar rasgos metabólicos y/o transcriptómicos relevantes para el sector enológico en estas especies. También se aporta nueva información sobre las especificidades de redistribución de flujos en la red metabólica de levaduras del género Saccharomyces acorde a la especie y las fluctuaciones ambientales que ocurren durante una fermentación vínica.[CAT] Saccharomyces cerevisiae, a més de ser un important organisme model en biologia, és indiscutiblement l'espècie de llevat més utilitzat en processos fermentatius industrials, incloent el sector enològic. La seua capacitat de fermentar grans concentracions de sucres, tolerar concentracions altes d'etanol i suportar l'addició de sulfits, són alguns dels factors que expliquen el seu èxit en fermentacions víniques. D'aquesta manera, el metabolisme fermentatiu de S. cerevisiae en condicions enològiques està ben descrit i es beneficia d'una àmplia bibliografia científica. En canvi, poc se sap encara sobre el metabolisme de les espècies de Saccharomyces criotolerants, S. uvarum i S. kudriavzevii, els qui han recentment suscitat l'interés del sector vitivinícola per les seues bones propietats fermentatives a baixes temperatures, com ara la producció de vins amb major contingut en glicerol, alta complexitat aromàtica i arribant a vegades a reduir el seu contingut en etanol. En aquest context, aquesta tesi pretén ampliar els nostres coneixements sobre el metabolisme fermentatiu de S. uvarum i S. kudriavzevii en condicions enològiques, aprofundint en l'enteniment de les diferències existents amb el de S. cerevisiae, així també com entre ceps de S. cerevisiae de diferents orígens. Per a això, hem utilitzat diverses tècniques omiques per a analitzar la dinàmica dels metabolomes (intra- i extracelul·lars) i/o transcriptomes de ceps representatius de S. cerevisiae, S. uvarum i S. kudriavzevii a alta (25 °C) i baixa (12 °C) temperatures de fermentació. També, hem desenvolupat un model metabòlic a escala del genoma que, al costat d'una anàlisi de balanç de fluxos, és capaç de quantificar els fluxos a través del metabolisme carbonat i nitrogenat de llevats en cultius de tipus batch. Així, el conjunt d'aquests treballs ens ha permés identificar trets metabòlics i/o transcriptómics rellevants per al sector enològic en aquestes espècies. També aporta nova informació sobre les especificitats de redistribució de fluxos en la xarxa metabòlica de llevats del gènere Saccharomyces concorde a l'espècie i les fluctuacions ambientals ocorrent durant una fermentació vínica.[EN] Saccharomyces cerevisiae, besides being an important model organism in biology, is undoubtedly the most widely used yeast species in industrial fermentation processes, including the winemaking sector. Its ability to ferment at high levels of sugars, tolerate high ethanol concentrations and withstand the addition of sulfites are some of the factors explaining its success in wine fermentation. Accordingly, the fermentative metabolism of S. cerevisiae under oenological conditions is well described and benefits from a large scientific literature. In contrast, little is known about the metabolism of the cryotolerant Saccharomyces species, S. uvarum and S. kudriavzevii, which have recently attracted the interest of the wine industry for their good fermentative properties at low temperatures, such as the production of wines with higher glycerol content, high aromatic complexity and sometimes even reduced ethanol content. In this context, this thesis aims to expand our knowledge on the fermentative metabolism of S. uvarum and S. kudriavzevii under oenological conditions, deepening our understanding of the existing differences with that of S. cerevisiae, as well as between S. cerevisiae strains of different origins. For this purpose, we have used several omics techniques to analyze the dynamics of the (intra- and extracellular) metabolomes and/or transcriptomes of representative strains of S. cerevisiae, S. uvarum and S. kudriavzevii at high (25 °C) and low (12 °C) fermentation temperatures. Also, we have developed a genome-scale metabolic model that, together with a flux balance analysis, is able to quantify fluxes through carbon and nitrogen metabolism of yeast in batch culture. Taken together, this work has allowed us to identify metabolic and/or transcriptomic traits relevant to the oenological sector in these species. It also provides new information on the specificities of flux redistribution in the metabolic network of Saccharomyces yeasts according to the species and environmental fluctuations occurring during wine fermentation.The present work has been carried out at the Department of Food Biotechnology of the IATA (CSIC). Romain Minebois was funded by a FPI grant (REF: BES-2016-078202) and supported by projects AGL2015-67504-C3-1R and RTI2018-093744-BC31 of the Ministerio de Ciencia e Inovación awarded to Amparo Querol.Minebois, RCM. (2021). Study of the differences in the fermentative metabolism of S. cerevisiae, S. uvarum and S. kudriavzevii species [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/176018TESISCompendi

Estudio de las diferencias en la regulación del metabolismo fermentativo en las especies del género Saccharomyces

[ES] En el presente trabajo, para entender las complejas variaciones que pueden existir a nivel fisiológico y en la regulación del metabolismo entre las especies de S. cerevisiae, S. uvarum y S. kudriavzevii durante la fermentación alcohólica en los mostos, nos proponemos de realizar un estudio metabolómico global. Se ha demostrado que estas tres especies han desarrollado diferentes estrategias en la regulación de su metabolismo respiratorio-fermentativo. Entre ello, las dos especies S. uvarum y S. kudriavzevii, tolerantes a las bajas temperaturas, han demostrado tener diferentes estrategias de resistencia a dichas temperaturas relacionadas con una mayor síntesis de glicerol. También, la especie S. uvarum demostró tener un incremento de actividad de su ruta de Shikimate (ruta de síntesis de alcoholes superiores y esteres) mientras que la especie S. kudriavzevii parece incrementar la síntesis de NAD+ para compensar el desequilibrio redox asociado a su producción de biomasa mayor. Estos últimos resultados parecen ser relacionados con la mayor síntesis de amino-ácidos y alcoholes superiores observados en estas especies durante fermentaciones. En este estudio, la bioinformática y las herramientas de biología tales como la reconstrucción de la expresión genómica, los datos de metabolómica, de transcriptómica y la modelización de los flujos metabólicos nos permitirán entender mejor los mecanismos implicados en la regulación de los procesos respiratorio-fermentativos y en el uso del glicerol en las especies S.cerevisiae, S. uvarum, S. kudriavzevii. Los resultados obtenidos también ayudarán a resolver los nuevos retos a los que se enfrenta la gente del sector vitivinícola, particularmente los debidos al cambio climático y a las nuevas demandas de los consumidores. En bioreactores, a 25°C y con mosto natural de uva blanca, reproduciendo las condiciones de fermentación en bodega, cuantificaremos las diferencias metabólicas entre las especies S. cerevisiae, S. uvarum y S. kudriavzevii. Por un lado, a lo largo de la fermentación, mediremos las concentraciones en metabolitos extracelulares de más relevancia: glucosa, fructosa, glicerol, etanol; ácido acético, ácido láctico, ácido cítrico, ácido succínico, amino-ácidos, alcoholes superiores y esteres. Por otro lado, los metabolitos intracelulares: ATP, ADP, AMP, glucosa 6 fosfato, fructosa 6 fosfato, NAD+, NADH, Piruvato, etc. Al mismo momento, mediremos los parámetros de la población de levaduras en los mostos en fermentación: número de levaduras y tamaño medio de las células. Toda esta información será utilizada por el grupo de informática del instituto IIC-CSIC de Vigo para modelizar los flujos metabólicos de las diferentes especies de Saccharomyces estudiadas.[EN] In recent years, there is a trend in the wine industry to produce aromatic wines with lower ethanol contents. Saccharomyces cerevisiae is the predominant yeast in wine fermentations because of its high fermentative capacity and ethanol resistance. However, the attributes provided by this species are not those demanded nowadays by the wine consumers. Therefore, new strategies are being introduced in the winemaking procedures to get wines with lower ethanol contents, more aromatic profile or with higher glycerol content. Wine fermentations conducted by other yeast species of the Saccharomyces such as cryotolerant S. uvarum and S. kudriavzevii are some of these new strategies. Indeed, it was observed that both species can reduce ethanol level in wine by a shift of the carbon flux toward the glycerol yield and aromatic compounds production, especially at low temperature. A sign that these species have developed different strategies in their regulation of the fermentative metabolism, like cold resistance mechanisms, that are different from the mechanisms displayed by wine strains of S. cerevisiae. This report is part of the results of a global system biology project based on multi-’omic’ experiments (metabolomic and transcriptomic) that will help us to understand and model the complex physiological and metabolic differences among S. cerevisiae, S. uvarum and S. kudriavzevii during a wine fermentation at low (12°c) and high temperature (25°c). In this work, we focused on the first metabolic data obtained from several wine fermentations performed at 25°C with a set of S. cerevisiae, S. uvarum and S. kudriavzevii yeast strains. In batch cultures, mimicking wine fermentations, we quantified the metabolic differences among these Saccharomyces strains. Along the wine fermentations, in very well controlled bioreactors, we measured the concentrations of the most important extracellular compounds – glucose, fructose, glycerol, ethanol, organic acids (acetic acid, lactic acid, citric acid, tartaric acid, malic acid, succinic acid), and aromas (higher alcohols and esters) – gas production (CO2 released during the fermentation process) and biomass parameters to identify signs of different metabolism strategies. The first results obtained from the fermentation performed at 25°C and presented below confirm that different fermentative mechanism exist among Saccharomyces species.Minebois, RCM. (2017). Estudio de las diferencias en la regulación del metabolismo fermentativo en las especies del género Saccharomyces. Universitat Politècnica de València. http://hdl.handle.net/10251/89759TFG