The role of dynamin during polarity establishment in C. elegans one-cell embryos

C. elegans Embryonen im Einzellstadium legen die anterior-posterior Polaritätsachse bereits kurze Zeit nach der Befruchtung fest. Die Entwicklung der Zellpolarität hängt von den Zentrosomen ab, welche vom Spermium zur Verfügung gestellt werden. Dies führt zu einer Veränderung der Aktivität des Aktin-Myosin-Netzwerkes in einer Hälfte des Embryos. Die Nähe zwischen Zentrosom und Cortex während der Entwicklung der Zellpolarität in C. elegans Einzellembryonen tritt auch in vielen anderen Zellpolarisierungen auf. Darunter wären zum Beispiel die T-Zellpolarisierung und die Spezifizierung hippokampischer Axone. In beiden dieser Beispiele spielt der intrazelluläre Vesikeltransport eine wesentliche Rolle für die Polarisierung der Zelle. Ich habe mich daher gefragt, ob der intrazelluläre Vesikeltransport auch in der Polaritätsentwicklung in C. elegans Embryonen eine grundlegende Rolle spielt. Für meine Experimente benützte ich ein bereits isoliertes temperatur-sensitives Allel von Dynamin, einer GTPase, die für die Vesikelbildung verantwortlich ist. Mit Hilfe von quantitativer Time-Lapse-Mikroskopie werden die Folgen der Inaktivierung von Dynamin zu bestimmten Zeitpunkten während der Entwicklung der Zellpolarität analysiert. Meine anfänglichen Experimente deuten darauf hin, dass Dynamin kurz vor oder während der Einleitung der Polaritätsentwicklung gebraucht wird, ähnlich wie die Zentrosomen. Manchmal jedoch scheint es als ob Dynamin auch noch einige Zeit nach der Einleitung der Zellpolarisierung gebraucht wird. Weitere Experimente sollten Aufschluss über den Effekt der Inaktivierung von Dynamin auf verschiedene Komponenten des Signalweges geben, der zur Entwicklung der Zellpolarität führt. Dafür wurden verschiedene neue Wurmstämme durch Kreuzungen generiert, die ein GFP-getaggtes Protein und das temperatursensitive Allel von Dynamin enthalten. Die GFP-getaggten Proteine sind bestimmte Marker für Komponenten des Vesikeltransportwegs, zum Beispiel RAB-5::GFP als Marker für frühe Endosomen. Manche der GFP-Stämmen standen bereits zur Verfügung, andere wurden durch Klonierungen und Wurmbombardierung erst neu hergestellt. Die mögliche Überexpression von PAR-3, einem Marker für anteriore Polarität, in den PAR-3::GFP Würmern ohne Dynamin führte zu einer stärkeren Ausprägung des Phenotyps gegenüber den temperatur-sensitiven Würmern alleine. Dies könnte möglicherweise durch die Veränderung des anterior-posterior PAR Proteinverhältnisses verursacht werden. In diesem Fall wäre es mögich, dass Dynamin parallel zu PAR-2, einem posterioren Polaritätsprotein, arbeitet. Diese Hypothese wird durch par-2 RNAi Experimente noch verstärkt, denn sie ergaben einen ähnlichen Phenotyp wie PAR-3::GFP in temperatur-sensitiven Würmern. Um noch näher auf das Thema einzugehen, machte ich weitere Versuche mit RNAi von anderen Vesikeltransportproteinen und behandelte Embryonen mit speziellen Vesikeltransportinhibitoren.One-cell C. elegans embryos establish the anterior-posterior polarity axis shortly after fertilization. Polarity establishment depends on a cue from the sperm-derived centrosomes, which subsequently leads to a change in acto-myosin activity in one half of the embryo. Centrosome-cortex proximity during polarity establishment in one-cell C. elegans embryos is paralleled in several other cell polarization events, specifically in T cell polarization and hippocampal axon specification. In both of these polarized cells, vesicle trafficking plays an integral role in polarization. I therefore wondered whether vesicle trafficking also plays an essential role in polarity establishment in C. elegans embryos. To study this question, I am taking advantage of a previously isolated temperature-sensitive allele of dynamin, a GTPase required for vesicle formation. Using quantitative time-lapse microscopy, I am analyzing the effects of dynamin inactivation at different times during polarity establishment. My initial experiments suggest that dynamin is required immediately prior to or during polarity initiation. This is similar to the temporal requirement for centrosomes. In some cases, dynamin is needed for a short time after initiation of polarity establishment. I am continuing to investigate the mechanism by which dynamin contributes to polarity establishment by analyzing the effect of dynamin inactivation on various components of the polarity establishment pathway. Therefore I generated worm strains expressing markers for specific components of the vesicle transport pathway. These strains and existing GFP lines, e.g. RAB-5::GFP, were crossed to the temperature sensitive dynamin strain to investigate the behavior of the endomembrane system in the absence of dynamin function. Overexpression of GFP::PAR-3, a marker of anterior polarity, in embryos lacking dynamin function led to more severe defects during polarity establishment than in the dynamin mutant alone. This might result from the change in the ratio of anterior and posterior PAR proteins, suggesting that dynamin could work in parallel to PAR-2, a posterior polarity protein. This idea is supported by experiments showing that dynamin mutant embryos depleted of PAR-2 have more severe polarity establishment defects than dynamin mutants alone. To further investigate this topic, I looked at the polarity establishment phenotypes of embryos depleted of other vesicle transport proteins by RNAi or treated with specific vesicle transport inhibitors