AntagomiR directed against miR-20a restores functional BMPR2 signalling and prevents vascular remodelling in hypoxia-induced pulmonary hypertension

Aims Dysregulation of the bone morphogenetic protein receptor type 2 (BMPR2) is a hallmark feature that has been described in several forms of pulmonary hypertension. We recently identified the microRNA miR-20a within a highly conserved pathway as a regulator of the expression of BMPR2. To address the pathophysiological relevance of this pathway in vivo, we employed antagomiR-20a and investigated whether specific inhibition of miR-20a could restore functional levels of BMPR2 and, in turn, might prevent pulmonary arterial vascular remodelling. Methods and results For specific inhibition of miR-20a, cholesterol-modified RNA oligonucleotides (antagomiR-20a) were synthesized. The experiments in mice were performed by using the hypoxia-induced mouse model for pulmonary hypertension and animal tissues were analysed for right ventricular hypertrophy and pulmonary arterial vascular remodelling. Treatment with antagomiR-20a enhanced the expression levels of BMPR2 in lung tissues; moreover, antagomiR-20a significantly reduced wall thickness and luminal occlusion of small pulmonary arteries and reduced right ventricular hypertrophy. To assess BMPR2 signalling and proliferation, we performed in vitro experiments with human pulmonary arterial smooth muscle cells (HPASMCs). Transfection of HPASMCs with antagomiR-20a resulted in activation of downstream targets of BMPR2 showing increased activation of Id-1 and Id-2. Proliferation of HPASMCs was found to be reduced upon transfection with antagomiR-20a. Conclusion This is the first report showing that miR-20a can be specifically targeted in an in vivo model for pulmonary hypertension. Our data emphasize that treatment with antagomiR-20a restores functional levels of BMPR2 in pulmonary arteries and prevents the development of vascular remodellin

Epigenetics, microRNAs and the activated phenotype of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts

Die meisten Menschen stellen sich unter „Rheuma“ altersbedingte Schmerzen in den Gelenken und durch Abnutzung verursachte Bewegungseinschränkung vor. Arthrose (oder Osteoarthritis) ist aber nur eine der vielen rheumatischen Erkrankungen, von denen allein in der Schweiz ca. 1,5 Millionen Menschen betroffen sind. Dabei ist „Rheuma“ keine Alterskrankheit. Dass alltägliche Bewegungsabläufe wie Kochen oder einen Brief schreiben zur schmerzhaften Herausforderung werden, kennen auch viele jüngere Menschen. Die rheumatoide Arthritis zum Beispiel, die häufigste entzündliche Gelenkserkrankung, tritt typischerweise ab dem dritten bis fünften Lebensjahrzehnt auf. Der Krankheitsverlauf ist meist chronisch und nur wenige Patienten können geheilt werden. Damit stellen die Krankheiten des rheumatischen Formenkreises nicht nur eine große individuelle Belastung dar, sondern verursachen auch enorme Kosten durch Arbeitsausfälle, medizinische Behandlungen, Begleiterkrankungen und z.T. auch eine verringerte Lebenserwartung. Die rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronisch-entzündliche Systemerkrankung, die vor allem die Gelenke betrifft. Die fortschreitende Zerstörung von Gelenksknorpel und Knochen bereitet den Patienten große Schmerzen und eine zunehmende Bewegungseinschränkung. Eine wichtige Rolle bei der Krankheitsentstehung spielt das Immunsystem, welches sich gegen die körpereigenen Gelenkstrukturen richtet und gemeinsam mit lokalen Gelenkszellen Knorpel und Knochen angreift. Bei RA handelt es sich somit um eine Autoimmunerkrankung. Synoviale Fibroblasten (SF), also Bindegewebszellen in der Gelenkskapsel (Synovialis), sind in der RA die wichtigsten Zellen, die den Knorpelabbau vorantreiben; diese „RASF“ schütten knorpel-abbauende Enzyme aus, dringen tief in das Knorpelgewebe ein und unterhalten durch die Produktion von entzündlichen Signalmolekülen die chronische Gelenksentzündung. Da die RASF diese Eigenschaften auch zeigen, wenn sie aus der chronisch-entzündlichen Umgebung des RA-Gelenks herausgenommen werden (d.h. ohne weitere Stimulation ausserhalb des Körpers kultiviert werden), spricht man auch von einem aktivierten Phänotyp. Es gibt verschiedene molekulare Ursachen für diesen aktivierten Phänotyp, u.a. das Anschalten von Onkogenen (d.h. von Genen, welche die Entstehung und das Wachstum von Tumoren fördern) und das Ausschalten der entsprechenden Gegenspieler, der Tumorsuppressoren. Aus der Krebsforschung ist bekannt, dass für diese Veränderungen oft epigenetische Mechanismen verantwortlich sind. Das sind Vorgänge, die die Genexpression beeinflussen ohne dabei die Sequenz des genetischen Materials, der DNA, zu verändern, und die dennoch während der Zellteilung vererbt werden können. Genauer gesagt wird das Chromatin (die Speichereinheit der DNA in der Zelle bestehend aus DNA und Histonproteinen) durch verschiedene chemische Modifikationen lokal so verändert, dass Genexpression zugelassen oder unterbunden wird. Eine weitere Instanz der Kontrolle der Genexpression, deren Bedeutung in den letzten Jahren immer deutlicher geworden ist, sind winzige RNA-Moleküle – microRNAs – von denen es über tausend verschiedene in menschlichen Zellen gibt. Eine bestimmte microRNA kann bis zu mehrere hundert unterschiedliche Gene kontrollieren und somit das Verhalten von Zellen entscheidend beeinflussen. Seit einigen Jahren gibt es immer mehr Hinweise dafür, dass der aktivierte Phänotyp der RASF durch epigenetische Veränderungen einerseits und durch die Fehlregulation verschiedener microRNAs andererseits bedingt wird. In meiner Doktorarbeit habe ich mich daher auf zwei bekannte Onkogene aus dem Feld der Epigenetik und aus dem Gebiet der miRNAs konzentriert, um deren Rolle in der Aktivierung der RASF zu untersuchen. Im ersten Projekt habe ich die Histonmethyltransferase Enhancer of Zeste homologue 2 (EZH2) untersucht, die die Aktivität ihrer Zielgene durch Methylierung des Histon 3 an Lysinrest 27 (H3K27) unterdrückt. Ich konnte zeigen, dass RASF erhöhte Mengen von EZH2 exprimieren und dies durch Stimulation mit entzündlichen Signalstoffen (tumour necrosis factor α [TNFα]) noch verstärkt werden konnte. Ich konnte weiterhin herausfinden, dass EZH2 in RASF die Expression eines wichtigen Inhibitorproteins unterdrückt, das secreted frizzled-related protein 1 (sFRP-1). Der Genpromoter von SFRP1 weist in RASF eine stärkere Methylierung von H3K27 auf und deshalb wird die Produktion von sFRP-1 unterbunden. Somit kann sFRP-1 den Wnt-Signalweg nicht mehr effektiv hemmen. Dieser ist in RASF aktiviert und trägt massgeblich zum aktivierten Phänotyp der RASF bei. Damit konnte ich mit diesem Projekt aufzeigen, dass die Histonmethyltransferase EZH2 durch epigenetische Regulation einen wichtigen Signalweg in der Pathogenese der RA beeinflusst. Im zweiten Projekt beschäftigte ich mich mit einem microRNA-Cluster, der eine wesentliche Rolle im Immunsystem spielt und der, wenn er in bestimmten Immunzellen zu stark exprimiert wird, Autoimmunität hervorrufen kann. Dieser microRNA-Cluster – miR-17-92 – kodiert für sechs verschiedene microRNAs, die alle unterschiedliche Zielgene haben. In RASF wird die Expression von miR-17-92 durch Stimulation mit TNFα aktiviert, wobei dies vom NF-κB Signalweg abhängig war, einem der wichtigsten entzündlichen Signalwege, die bei RA dauerhaft aktiv sind. Um herauszufinden, welche Rolle einzelne microRNAs dieses Clusters in der Aktivierung der RASF spielen, wurden diese künstlich (d.h. durch Transfektion) in RASF eingebracht. Dabei konnte ich feststellen, dass miR-18a spezifisch die Expression von knorpel-abbauenden Enzymen und entzündlichen Mediatoren in RASF verstärkte. Mit Hilfe von Computer-basierten Vorhersageprogrammen wurden verschiedene mögliche Zielgene der miR-18a ermittelt. Durch die anschliessende experimentelle Validierung konnte der NF-κB-Signalweg-Inhibitor TNFα-induced protein 3 (TNFAIP3) als neues Zielgen der miR-18a identifiziert werden. Die Transfektion von miR-18a verstärkte somit das NF-κB-Signal in RASF. Zusammenfassend konnte so ein neuer positiver Feedback-Mechanismus entdeckt werden, bei dem TNFα den NF-κB-Signalweg wie auch die miR-18a induziert, wobei die miR-18a über die Hemmung des NF-κB-Inhibitors TNFAIP3 zu einer zusätzlichen Verstärkung des NF-κB-Signalwegs führt