Conditions de développement de symptômes de Lasiodiplodia theobromae sur cacao, in vitro

Les champignons des genres Calonectria et Lasiodiplodia sont souvent associés aux blessures occasionnées par les piqures des mirides, et peuvent causer des nécroses importantes sur les parties aériennes du cacaoyer. Ces nécroses peuvent conduire progressivement à la mort de l'arbre. Les travaux menés au CIRAD Montpellier dans le cadre du projet CFC/ICCOlBioversity " Cocoa Productivity and Quality Improvement, a Participatory Approach " visaient à développer un test d'inoculation dans le double objectif de comparer l'agressivité de souches de Lasiodiplodia et/ou Calonectria provenant de plusieurs pays et d'évaluer le niveau de résistance à ces champignons de clones de cacaoyers présents dans la serre de Montpellier. Nous avons reçu et identifié à l'aide des séquences ITS, comme appartenant à Lasiodiplodia theobromae, 2 souches du Cameroun, 2 souches du Nigeria, 1 souche de Côte d'Ivoire et 2 souches de Guyane. Nous avons donc focalisé notre étude sur cette espèce. En raison de la faible quantité de matériel végétal disponible dans notre serre en zone tempérée, nos efforts ont porté sur le développement d'un test d'inoculation sur tronçons de baguettes, in vitro. Les meilleures conditions de conservation des baguettes, de développement et d'évaluation des symptômes ont été les suivantes: utiliser des baguettes semi-aoûtées, de l'ordre de 1 cm de diamètre et 10-12 cm de long; paraffiner les extrémités des baguettes pour éviter l'apparition de nécroses dues à des infections naturelles provoquées par d'autres organismes; inoculer à l'aide d'un disque de culture mycélienne après avoir blessé les tissus avec une aiguille. Les souches sont mises en culture pendant 15 à 20 jours sur milieu V8, à 25°C, et sous régime de lumière alternée 12h!12h; incuber les baguettes dans des bacs, à 25°C, en lumière alternée, sous humidité relative élevée; mesurer la longueur des lésions en surface et en profondeur dans les vaisseaux du xylème après 2 semaines d'incubation. Les témoins blessés non inoculés n'ont pas développé de symptômes. Nous avons pu ré-isoler L. theobromae au niveau des nécroses qui se développent le long des vaisseaux des baguettes inoculées. Au cours d'expérimentations préliminaires, les différences observées entre souches n'étaient pas toujours significatives mais les interactions clone x souche étaient toujours non significatives. Nous avons donc utilisé par la suite les souches les plus agressives du Nigeria et du Cameroun pour les tests du niveau de résistance des clones. Des différences significatives entre clones ont pu être mises en évidence de façon ponctuelle pour la longueur des lésions en surface et en profondeur. Des expérimentations complémentaires sont en cours afm d'assurer la répétabilité du test pour une gamme de clones plus importante. (Texte intégral

Obtention de descendances de Phytopthora megakarya agent pathogène de la pourriture brune des cabosses du cacaoyer en Afrique

La maladie de la pourriture brune des cabosses du cacaoyer est causée par plusieurs espèces de Phytophthora. En Afrique, l'espèce responsable est P. megakarya. Cette espèce est la plus destructrice et concerne le premier continent producteur de cacao. Dans le cadre de ce travail, nous avons réalisé 12 croisements entre souches de P. megakarya provenant de différentes populations (2 Afrique de l'Ouest : Nigeria et 4 Afrique Centrale : Cameroun) afin d'obtenir des descendances. Pour chaque population, des souches de signe de compatibilité sexuelle A 1 et A2 ont été choisies. Les souches sélectionnées et croisées ont également des niveaux d'agressivité différente. Le principal objectif de l'obtention de ces descendances est d'établir une carte génétique de P. megakarya et de caractériser des marqueurs d'agressivité (Q1L). Une méthode permettant la germination des oospores de P. megakarya a été mise au point, ce qui n'avait jamais été réalisé auparavant. Nous avons obtenu le développement de souches hybrides à partir de la germination d'oospores pour 8 croisements. Le nombre de souches isolées par croisement est compris entre 3 1 et 97. Le meilleur croisement a été NGR20 (Nigeria, A 1 ) par Ml84 (Cameroun, A2) avec 97 souches développées. L'utilisation des marqueurs moléculaires RAPD a permis de confirmer le caractère hybride et d'éliminer les souches provenant d'oospores autofécondées. Dans le cas du croisement NGR20 x Ml84, seulement 4 souches " autofécondées " ont été éliminées. Les 93 souches hybrides de cette descendance ont été croisées avec des souches de référence pour leur signe de compatibilité sexuelle : 53 souches sont de signe Al et 40 souches de signe A2. Cela montre que des souches A2 peuvent être obtenues par reproduction sexuée avec une fréquence proche de celle des Al. Toutefois au Onneroun tontes les souches isolées actuellement sur cacaoyer sont de signe Al, et aucune de signe A2, ce qui est un argument pour penser que la reproduction sexuée de P. megakarya sur cacaoyer au Cameroun est un événement très rare. Toutes les 93 souches sont capables de produire des chlamydospores et donc de survivre à des conditions défavorables existantes lors des saisons sèches. Cette descendance a permis de débuter les travaux concernant l'obtention d'une carte génétique. Des marqueurs moléculaires RAPD, AFLP et SSR sont utilisés pour saturer les différents groupes de liaisons de cette espèce. Le niveau d'agressivité de chaque hybride est en cours de caractérisation par test " feuille " et permettra de commencer une étude de marqueurs d'agressivité (QTL) placés sur les différents groupes de liaisons. La souche NGR20 est très agressive et la souche Ml84 est peu agressive. Ceci afin de mieux comprendre les mécanismes de contournement de résistance du cacaoyer par cette espèce. (Texte intégral

Identification of Theobroma cacao genes differentially expressed during Phytophthora infection

Pod rot, caused by different species belonging to the genus Phytophthora, is the main cause of harvest losses worldwide for cocoa production. Between 15% to 80% of losses could be observed according to the Phytophthora species, P. megakarya being the most aggressive. Varieties¿ improvement with a sustainable resistance has been identified as a priority of research programs of producer countries with about 14 millions of workers getting their income from the cocoa cultivation. Cocoa resistance to Phytophthora is quantitative and polygenic. The objectives of this project is to improve our knowledge of molecular mechanisms involved in the partial cocoa resistance in order to develop efficient tools of breeding to increase the resistance level of cocoa trees. This work aims to develop functional genomic approaches to identify candidate genes involved in this partial resistance. Suppression subtractive hybridisation (SSH) was used to generate cDNA libraries representing genes differentially expressed in response to cocoa/Phytophthora interactions. More than 15,000 ESTs were sequenced (in the frame of a GENOSCOPE project) and used for these studies. ESTs were analyzed by Blastn and/or Blastx search against NCBI data base. A little part of the clones had no homology with sequences and/or function already describe. The other part had significant matches to known genes. Among them, sequence homologies were found with pathogenesis related function knowledge, as PR protein (PR-1, glucanase, chitinase...), kinases, receptors (LRR), and transduction factors. Gene expression was conducted on leaf tissues of a progeny created in Papoua Nouvelle Guinea derived from a cross implied forastero and haut amazonien. Two resistant individuals with the better allele combination and two susceptible individuals with the less allele combination were kept and used for this work. Nylon cDNA macro arrays were used to assess the differentially expressed genes of the resistant and the susceptible cocoa clones infected by Phytophthora megakarya.. Libraries were screened with the inoculated-subtracted probes and non-inoculated reverse-subtracted probes, to reduce the candidate clones. We developed a novel set of macro arrays and obtained expression profiles during the several steps of phytophthora infection kinetic. Several genes differentially regulated between resistant/susceptible individuals revealed in this study are already known as integrated in signal transduction or in plant defence responses of other species. (Texte intégral

Quel a été le processus d'émergence de Phytophthora Megakarya sur cacaoyer au Cameroun ?

Au Cameroun, la principale espèce responsable de la pourriture brune des cabosses du cacaoy~r (Theobroma cacao L.) est Phytophthora. megakarya. Cet agent pathogène détruit en moyenne 50 % de la production camerounaise de cabosses. Depuis le début des années 1920, cette espèce a colonisée toute l'Afrique Centrale et continue son expansion en direction de l'Afrique de l'Ouest. EUe remplace progressivement P. palmivora. Elle a atteint en 2008, l'Ouest de la Côte d'Ivoire, la première zone de production de cacao mondiale. De ce fait elle représente la plus grande menace phytosanitaire pour le marché cacao mondial. Toutefois P. megakarya a été isolé uniquement en Afrique alors que le cacaoyer est originaire d'Amérique. Alors qu'elle est l'origine et le processus d'émergence de cette espèce? Après des recherches bibliographiques approfondies et nos propres travaux concernant la diversité génétique de ce parasite, il semble que deux hypothèses de mécanismes d'émergence soient possibles. Dans le cadre d'un projet ANR français " Emerfundis " (2008-2010), les deux hypothèses vont être testées en collaboration avec l'IRAD Cameroun. Les deux hypothèses de mécanismes d'émergence sont les suivantes: ---soit un saut d'hôte d'une plante hôte originelle endémique du Cameroun sur cacaoyer au moment de son introduction au Cameroun dans les années 1890-1900. Des prospections dans les zones putatives d'origines de P. megakarya (zone Bipendi et Fako) sont en cours de réalisation afin d'une part de trouver la plante hôte originelle et d'autre part de confinner que le maximum de diversité génétique se situe bien dans ces zones d'origines putatives. Les souches sont transférées et caractérisées au Cirad Montpellier par AFLP, RAPD et microsatellites. ---soit par évolution génétique: P. megakarya pourrait venir de la fusion de chromosomes de P. palmivora . Cette dernière espèce possède 10 à 12 chromosomes qui par un phénomène de fusion Robertsoniène par centromère auraient pu donner les 5 à 6 gros chromosomes de P. megakarya. La comparaison de marqueurs sur chromosomes des 2 espèces par la Technique M-Fish est en cours de réalisation au Cirad Montpellier. En complément, les cartes génétiques de P. megakarya et de P. palmivora sont en cours de réalisation afin de comparer les groupes de liaisons des deux espèces. Ces travaux nous penneitront de mieux comprendre l'évolution de ce pathogène au Cameroun sur cacaoyer et d'éviter certaines associations culturales qui favoriseraient le passage de certaines plantes porteuses de P. megakarya sur cacaoyer si 1'hypothèse 1 est vérifiée. Ils pennettront également d'expliquer pourquoi le remplacement de P. palmivora par cette nouvelle espèce se fait aussi rapidement en Afrique, si l'hypothèse de fusion de chromosomes est vérifiée. (Texte intégral

Structure et dynamique des populations de Phytophtora sp parasite du cacaoyer en Côte d'Ivoire

En Côte d'Ivoire, l'apparition de Phytophthora megakarya dans la zone Est du verger de cacaoyers s'est traduite par un accroissement substantiel des pertes de récolte dues à la pouniture brune des cabosses. Dans cette région, le niveau des pertes qui étaient estimées à 10 % en moyenne avec Phytophthora palmivora, varient actuellement de 30 à 45 %. Ce chiffre avoisine les 60% de perte dans certaines localités. La lutte contre la pouniture brune des cabosses est donc devenue une priorité. Afin d'élaborer une stratégie de lutte efficace, une collecte d'isolats de Phytophthora a été réalisée dans toutes les zone de production de cacao du pays. La strùcture et la diversité des populations de Phytophthora à été étudiée par les marqueurs biochimiques (isozYI!les) et moléculaires (RAPD). Les résultats obtenus, mettent en relation l'explosion de la maladie et la progression de P. megakarya dans le verger. Les résultats obtenus et La stratégie de lutte préconisée seront discutés. (Texte intégral

Identification de gènes de Theobroma cacao exprimés de façon différentielle pendant une infection par Phytophthora

La pourriture brune des cabosses, provoquée par plusieurs espèces de Phytophthora, est présente dans toutes les zones de production cacaoyère et constitue l'une des principales causes de perte de récolte de T. cacao. Les traitements chimiques contre cette maladie sont possibles mais ils sont contraignants, coûteux, polluants et ne s'intègrent pas dans un processus durable de gestion des plantations de cacao. La résistance du cacaoyer à Phytophthora est quantitative et polygénique. L'objectif de ce travail est de faire progresser notre connaissance des mécanismes moléculaires intervenant dans la résistance partielle du cacaoyer, de façon à développer des outils efficaces de sélection pour augmenter le degré de résistance des cacaoyers. Ces travaux visent à développer des approches génomiques fonctionnelles pour identifier les gènes candidats impliqués dans cette résistance. Des ressources de séquences exprimées ont été accumulées au cours des dernières années sur les interactions T. cacao/P. palmivora. Parmi celles-ci, des séquences correspondant aux gènes impliquées dans les réponses de stress biotique ont été sélectionnées et utilisées pour démarrer des études de génomique fonctionnelle. Une puce à ADN en lien avec les interactions cacaoyer/Phytophthora a été construite à partir d'une collection unigène de 3200 séquences de la plante, 50 séquences de Phytophthora sp. (base de données NCIS) et 20 séquences génériques pour la normalisation des puces. Des gènes exprimés de façon différentielle ont été observés dans le génotype résistant Scavina6 avant et après des inoculations de P. palmivora par des tests artificiels effectués sur les feuilles. Des échantillons des feuilles infectées ont été collectés 0, 1, 4, 8, 24, 48, 72 et 96 heures après l'inoculation. Des copies des gènes exprimées à chacun de ces moments ont été étiquetés et des hybridations de puce ADN ont été effectuées sur la plateforme Biopuces de Toulouse (http://biopuces.genotoul.fr/). Après les analyses des images, les données ont été analysées par le logiciel BioPlot/Biodust accessible sur la plateforme. Près de 250 gènes surexprimés entre 3 et 20 fois dans les feuilles inoculées ont été identifiés. Parmi eux, 80 ont été spécifiquement induits 8 heures après l'inoculation tandis que 50 ont été induits 48 h après. Les autres gènes étaient répartis à différents horaires après l'inoculation. L'expression des gènes fortement induits ou associés avec les régions des QTL de résistance (communes à plusieurs génotypes et identifiées sur les chromosomes 1, 4 et 9) ont été confirmées par une Rt-PCR quantitative. (Texte intégral

Identification de gènes de Theobroma cacao différemment exprimés pendant une infection par Phytophthora megakarya

La pourriture des cabosses, provoquée par différentes espèces appartenant au genre Phytophthora, est la principale cause de pertes de récolte dans la production cacaoyère au niveau mondial. On a pu observer entre 15 et 80 % de pertes selon les espèces de Phytophthora, P. megakarya étant la plus agressive. L'amélioration des variétés présentant une résistance durable a été identifiée comme une priorité pour les programmes de recherche des pays producteurs, dans lesquels environ 14 millions de travailleurs tirent leurs revenus de la culture du cacao. La résistance du cacaoyer à Phytophthora est quantitative et polygénique. L'objectif de ce projet est de faire progresser notre connaissance des mécanismes moléculaires intervenant dans la résistance partielle du cacaoyer, de façon à développer des outils efficaces de sélection pour augmenter le degré de résistance des cacaoyers. Ces travaux visent à développer des approches génomiques fonctionnelles pour identifier les gènes candidats impliqués dans cette résistance partielle. L'hybridation soustractive suppressive (SSH) a été utilisée pour constituer les bibliothèques d'ADNc représentant des gènes différemment exprimés en réponse aux interactions cacaoyer/Phytophthora. Les EST ont été séquencées et analysées par recherche Blastn et/ou Blastx par comparaison à la base de données NCB!. Des homologies de séquence ont été découvertes avec les gènes liés à la pathogénie avec une fonction connue et identifiée à partir de la plante, comme les protéines PR (PR-l, glucanase, chitinase...), les kinases, les récepteurs (LRR), les facteurs de transduction et aussi à partir du pathogène, comme la protéine inhibitrice du glucanase. Nous avons mis au point une puce cADN nylon avec ces séquences EST candidates pour évaluer les gènes qui s'expriment différemment entre les clones de cacaoyers résistants et sensibles infectés par Phytophthora megakarya. L'expression génique a été menée sur des tissus foliaires d'un descendant créé en Papouasie Nouvelle Guinée issu d'un croisement faisant intervenir des génotypes Trinitario et Upper Arnazon Forastero du Pérou. Deux individus résistants avec la meilleure combinaison d'allèles et deux individus sensibles avec la moins bonne combinaison d'allèles ont été conservés et utilisés pour ce travail. Plusieurs gènes régulés différemment entre les individus résistants/sensibles ont été révélés par cette étude. Les résultats ont été confirmés par des expériences de RT-PCR quantitative et ont révélé l'induction précoce d'un gène de kinase pendant les premières heures de l'infection et une expression ultérieure d'une protéine PRo L'expression des différentes protéines inhibitrices de glucanase, exprimée par l'agent pathogène, dans les clones de cacaoyer sensibles a également été discutée. (Texte intégral