Konformationelle Dynamik des Ras-Proteins und ihre Bedeutung für die Effektor-Wechselwirkung

Das Guaninnukleotid-bindende Protein Ras ist als molekularer Schalter in zellulären Signaltransduktionswegen involviert, die zu Proliferation, Differenzierung oder Apoptose von Zellen führen. Dabei wechselt Ras zwischen einer inaktiven, GDP-gebundenen und einer aktiven, GTP-gebundenen Form. In der aktiven Kon-formation kann Ras über die Schalter I-Region mit hoher Affinität verschiedene Effektoren wie die Raf-Kinase oder RalGDS binden. Dadurch werden die Signale weitergeleitet und die entsprechenden Zellantworten bewirkt. In dieser Arbeit wurden Ras(wt), die onkogene Mutante Ras(G12V) sowie einige Schalter I-Mutanten in Lösung untersucht. Im Gegensatz zu den Ergebnissen aus der Röntgenkristallographie zeigen die hier durchgeführten Mn2+-EPR- und 31P-NMR-Untersuchungen an der inaktiven und aktiven Form von Ras in Lösung, dass sowohl die Koordination des im aktiven Zentrum gebundenen Metallions, als auch die der Phosphate des gebundenen Nukleotids in den unterschiedlichen Ras-Varianten verschieden sind. Aber auch innerhalb den einzelnen Ras-Varianten treten unterschiedliche Konformationen auf. Ras(wt) kann in der aktiven Konformation in zwei konformationellen Zuständen vorliegen (Zustand 1 und 2), die sich im chemischen Austausch miteinander befinden. Der Zustand 2 wird durch die Bindung von Effektoren stabilisiert und sollte der Effektor-gebundenen Konformation ähnlich sein. Das Gleichgewicht zwischen den beiden Zuständen wird durch die GTP-Analoga GppNHp und GppCH2p, sowie auch durch Mutationen in der Schalter I-Region von Ras zum Zustand 1 verschoben. Auf Kalorimetrie und Fluoreszenz basierende Bindungsstudien dieser Arbeit zeigen, dass diese konformationellen Gleich-gewichte einen direkten Einfluss auf die Ras-Effektorwechselwirkun

Rapid assignment of solution ^{31}P NMR spectra of large proteins by solid-state spectroscopy

The application of the 31P NMR spectroscopy to large proteins or protein complexes in solution is hampered by a relatively low intrinsic sensitivity coupled with large line widths. Therefore, the assignment of the phosphorus signals by two-dimensional NMR methods in solution is often extremely time consuming. In contrast, the quality of solid-state NMR spectra is not dependent on the molecular mass and the solubility of the protein. For the complex of Ras with the GTP-analogue GppCH2p we show solid-state 31P NMR methods to be more sensitive by almost one order of magnitude than liquid-state NMR. Thus, solid-state NMR seems to be the method of choice for obtaining the resonance assignment of the phosphorus signals of protein complexes in solution. Experiments on Ras·GDP complexes show that the microcrystalline sample can be substituted by a precipitate of the sample and that unexpectedly the two structural states observed earlier in solution are present in crystals as well