2 research outputs found
Variability of a glycoprotein and a G-protein-coupled receptor (UL55, UL33) of cytomegalovirus
Zytomegalie-Viren (HCMV) sind Krankheitserreger, die im Menschen lebenslang
persistieren und eine Vielzahl von klinischen Manifestationen verursachen
können, welche insbesondere bei immunsupprimierten Patienten auftreten.
Vergleiche klinischer HCMV-Isolate zeigen multiple polymorphe Genbereiche,
eine Serotypeneinteilung existiert bisher jedoch nicht. Die Versuche
verschiedener Autoren, Zusammenhänge zwischen dem klinischem Ablauf einer
HCMV-Infektion und bestimmten Genotypen einzelner Genbereiche festzustellen,
fĂĽhrten bisher lediglich zu einer widersprĂĽchlichen Studienlage, ohne
unmittelbare Praxisrelevanz. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine PCR-
basierte Methodik zu entwickeln, die in klinischem Probenmaterial zusätzlich
auch hochdivergente Genotypen und mehrere Genotypen in einer Probe nachweisen
kann. Die Entwicklung und Evaluation der Methodik erfolgte an Glykoprotein B
(gB). Nachfolgend wurde die Polymorphie von UL33, einem CMV-kodierten G
-Protein-gekoppelten Rezeptor, untersucht. DafĂĽr wurden degenerierte nested-
PCR-Systeme entwickelt, die hochsensitiv (≤10 Kopien / µl) einen Bereich um
die Schnittstelle von gB beziehungsweise das gesamte UL33-Gen amplifizieren
können. An Primaten-CMV (aus Schimpansen und Gorillas) konnte durch
Amplifikation teilweise bisher unbekannter gB- und UL33-Sequenzen die
Vielseitigkeit beider degenerierter nested-Primersysteme bestätigt werden. Bei
Untersuchungen mischinfizierter Proben mit degenerierten Primern wird,
abhängig von Viruslast und Primeraffinität, vorwiegend ein Genotyp
amplifiziert. Andere vorkommende Genotypen werden hingegen nicht detektiert.
Um diese nicht detektierten Genotypen nachzuweisen, wurde der erstdetektierte
Genotyp durch antisense-Oligonukleotide von der Amplifikation ausgeschlossen.
Hierbei kamen als Nukleinsäure-Analoga locked-nucleic-acid Oligonukleotide
(LNA) zum Einsatz. Es konnte gezeigt werden, dass – im Gegensatz zu
Vermutungen anderer Autoren – LNA von mehr als 12 Basenpaaren Länge als
spezifische antisense-Oligonukleotide dienen können. So erlaubten die für die
vier gB-Genotypen synthetisierten LNA die spezifische Amplifikation eines
unterrepräsentierten gB-Genotypen aus einer artifiziell vierfach
mischinfizierten Probe. Nachfolgend konnten die HCMV aus 30 Proben
immunsupprimierter Patienten genotypisiert werden. Hierbei ergaben sich
Hinweise darauf, dass der Anteil gB-mehrfachinfizierter Immunsupprimierter
höher ist, als derzeit vermutet. Folgende Bezeichnungen von UL33-Genotypen
wurden vorgenommen: Stamm Merlin als UL33-1, Stamm Toledo als UL33-2 und Stamm
AD169 als UL33-3. Genotyp UL33 4 konnte erstmals in dieser Arbeit nachgewiesen
werden. Die Sequenzanalyse des putativen, gespleiĂźten Proteinprodukts zeigte
den neuen Genotypen als divergentesten mit größter Ähnlichkeit zu UL33-1 mit
94% Übereinstimmung auf Aminosäureebene. In der Gruppe der immunsupprimierten
Patientenproben wurden die UL33-Genotypen 1-3 mit abnehmender Häufigkeit
nachgewiesen. Insgesamt 30% der Proben zeigten HCMV-Infektionen mit mehreren
UL33-Genotypen. Vergleiche der Sequenzvariabilität mit Strukturberechnungen
des UL33-Rezeptors lassen eine Variabilität vor allem der extrazellulären
Rezeptoranteile vermuten. Daher sollten zukĂĽnftige Studien zum Nachweis des
natĂĽrlichen Liganden von UL33 unter anderem auch mit UL33-1 erfolgen. Die UL33
-nested-PCR und die zugehörigen LNA ermöglichten die Amplifikation des
kompletten UL33-Gens mit allen seinen genotypischen Varianten. Die in dieser
Arbeit entwickelte Methodik erlaubt den Nachweis bisher unbekannter
hochdivergenter CMV-Genotypen und zeigt erstmals die Funktionalität von reinen
LNA als inhibierende antisense-Oligonukleotide in degenerierten PCR.Cytomegalovirus infections can cause serious problems in fetus, newborns and
immunocompromised patients, and viral DNA is usually detected with specific
PCR. An unprejudiced way of analysing human samples for the presence of known
and unknown cytomegalovirus genotypes is to use degenerate primers. However,
in mixed infections, only one dominant genotype is usually amplified. Here, we
present a modification of degenerate nested PCR by utilizing oligonucleotides
of locked nucleic acids (LNA) to specifically block the genotype sequence
which is preferentially amplified in the PCR reaction. This technology was
used to detect and differentiate genotypic variants of the glycoprotein B gene
(UL55) and a G-protein-coupled receptor gene (UL33) of human cytomegalovirus
(HCMV). Two nested degenerate primer pairs were designed which broadly
amplified hominoid CMV (from men and chimpanzees). With the help of UL55- and
UL33-specific LNA, a collection of clinical samples was differentially
screened for the occurrence of multiple infections with HCMV genotypes. The
five gB and the three UL33 genotypic variants known to date were identified,
and a novel fourth UL33 genotype was discovered
Telehealth Needs and Concerns of Stakeholders in Pediatric Palliative Home Care
Pediatric palliative home care (PPHC) provides care for children, adolescents, and young adults with life-limiting illnesses in their own homes. Home care often requires long travel times for the PPHC team, which is available to the families 24/7 during crises. The complementary use of telehealth may improve the quality of care. In this pilot study we identify the needs and concerns of patients, teams, and other stakeholders regarding the introduction of telehealth. As a first step, focus groups were conducted in three teams. For the second step, semi-structured interviews were conducted with patients and their families (n = 15). Both steps were accompanied by quantitative surveys (mixed methods approach). The qualitative data were analyzed using content analysis. A total of 11 needs were identified, which were prioritized differently. Highest priority was given to: data transmission, video consultation, access to patient records, symptom questionnaires, and communication support. The concerns identified were related to the assumption of deterioration of the status quo. Potential causes of deterioration were thought to be the negative impact on patient care, inappropriate user behavior, or a high level of technical requirements. As a conclusion, we define six recommendations for telehealth in PPHC