Deciphering GRINA/Lifeguard1: Nuclear Location, Ca2+ Homeostasis and Vesicle Transport

The Glutamate Receptor Ionotropic NMDA-Associated Protein 1 (GRINA) belongs to the Lifeguard family and is involved in calcium homeostasis, which governs key processes, such as cell survival or the release of neurotransmitters. GRINA is mainly associated with membranes of the endoplasmic reticulum, Golgi, endosome, and the cell surface, but its presence in the nucleus has not been explained yet. Here we dissect, with the help of different software tools, the potential roles of GRINA in the cell and how they may be altered in diseases, such as schizophrenia or celiac disease. We describe for the first time that the cytoplasmic N-terminal half of GRINA (which spans a Proline-rich domain) contains a potential DNA-binding sequence, in addition to cleavage target sites and probable PY-nuclear localization sequences, that may enable it to be released from the rest of the protein and enter the nucleus under suitable conditions, where it could participate in the transcription, alternative splicing, and mRNA export of a subset of genes likely involved in lipid and sterol synthesis, ribosome biogenesis, or cell cycle progression. To support these findings, we include additional evidence based on an exhaustive review of the literature and our preliminary data of the protein–protein interaction network of GRINA

Conjugal transfer of the Salmonella enterica virulence plasmid in the mouse intestine

BALB/c mice were infected with two Salmonella enterica serovar Typhimurium strains, one of which lacked the virulence plasmid. Transconjugants were found at high frequencies in the mouse feces and at low frequencies in the liver and the spleen, suggesting that mating occurred in the gut. Laboratory conditions that mimic those of the small intestine (microaerophilic growth in the presence of 0.3 M NaCl) increased the frequency of virulence plasmid transfer. Sodium deoxycholate, which is found at high concentrations in the duodenum, and sodium propionate, which is abundant in the large intestine, reduced the conjugation frequency. Feces inhibited conjugation. Altogether, these observations suggested that transfer of the virulence plasmid occurred in the distal portion of the small intestine. Conjugation trials in ileal loops provided direct evidence that conjugal transfer of the Salmonella virulence plasmid occurs in the ileum in mice

Dependencia a colistina debida a la pérdida de lipolisacáridos en Acinetobacter baumannii

Motivación: Determinar la causa genotípica de la dependencia a colistina (1) en Acinetobacter baumannii de estirpes seleccionadas resistentes a colistina, el cual es un antibiótico muy utilizado en clínica para combatir cepas múltirresistentes. Estos mutantes presentan una mutación de pérdida de función en genes esenciales para la biosíntesis del lípido A, que forma parte del lipopolisacáridos (LPS). Henry et al. demostraron que estas estirpes sin LPS tienen alterados los niveles de expresión de otros genes que dan lugar, entre otras cosas, al incremento de sistemas de transporte de lipoproteínas, fosfolípidos y exopolisacáridos para compensar la pérdida del LPS en la membrana externa (2). Por tanto, este fenómeno produce la modificación de la membrana con la consecuente resistencia a colistina y un aumento de permeabilidad.Métodos: Se utilizaron cinco cepas clínicas multirresistentes aisladas de pacientes infectados en las UCIs del hospital Virgen del Rocío, una estirpe tipo sensible. Además, se incluyó una estirpe resistente a colistina con una modificación en el LPS en lugar de ausencia del mismo. Para visualizar la dependencia a colistina, en primer lugar se realizaron ensayos E-test en placas de medio rico con Mueller Hinton Broth (MBHII), usando tiras de colistina. El efecto de dependencia a colistina se estudió en curvas de crecimiento en medio líquido MHBII en agitación a 37ºC en placas multipocillos, comparando el número de ufc/ml de la misma estirpe en ausencia o presencia de colistina a 5 μg/ml.Resultados: Todas las estipes clínicas presentaron una concentración mínima inhibitoria a colistina >256 μg/ml, mientras que la de la estirpe tipo resistente a colistina fue de 48 μg/ml y la cepa con LPS modificado fue 32 μg/ml. Sólo en las cepas sin LPS se observó un halo de mayor crecimiento alrededor de la tira en comparación a la zona alejada de la misma, lo que indica la dependencia a este antibiótico.Respecto a la curva de crecimiento, la presencia de colistina aceleró la entrada en fase exponencial en todas las estirpes en comparación al medio rico sin colistina, alcanzando 1,71 veces más crecimiento en colistina a las 24 horas.Conclusiones: Nuestros resultados muestran que la pérdida de LPS no sólo confiere resistencia a colistina si no que además crea una dependencia a este antibiótico. Sin embargo, este fenómeno de dependencia a colistina no ocurre si la resistencia se ha adquirido por modificación del LPS

La inhibición de LpxC reduce la resistencia intrínseca de A. baumannii a diferentes clases de antibióticos

Motivación: Acinetobacter baumannii es una bacteria Gram-negativa oportunista que ha emergido como una de las bacterias patógenas nosocomiales altamente resistente más comunes alrededor de todo el mundo. Se asocia con una serie de infecciones nosocomiales incluyendo bacteremia, pneumonía, meningitis e infecciones del tracto urinario. La mayoría de estas infecciones son causadas por cepas con alta resistencia a antibióticos usados en las unidades de cuidados intensivos, donde son un problema común. El tratamiento de estas infecciones es obstaculizado por el aumento de cepas de A. baumannii que son resistentes a casi todos los antibióticos disponibles. La monocapa exterior de la membrana externa de las bacterias Gram negativas está formada por un componente denominado lípido A, también llamado endotoxina, que forma parte del LPS, un lipopolisacárido que se encuentra insertado en la pared celular de bacterias Gram negativas. El LPS es pirogénico, responsable de la fiebre, y también causa shock endotóxico. Las enzimas que intervienen en la ruta de biosíntesis del lípido A se han propuesto como nuevas dianas de fármacos y terapias para el tratamiento de la infección. Nuestro trabajo presenta una alternativa a los antibióticos convencionales para tratar cepas multirresistentes consistente en una inhibición enzimática de la biosíntesis de la endotoxina mediante la inhibición de LpxC, una enzima cuya inhibición afectaría a la biosíntesis del lípido A, que protege a la bacteria del ataque de antibióticos.Métodos: Empleamos cepas clínicas de A. baumannii, así como mutantes de lpxA resistentes a colistina, y cepas complementadas con y sin el gen insertado. Medida de toxicidad del LPS, después del tratamiento con inhibidor usando un ensayo LAL. Medida de LPS, específicamente diferencias en el lípido A, mediante un kit. La resistencia a diferentes antibióticos se caracterizó mediante CMI.Resultados: Tras el tratamiento con el inhibidor obtenemos una disminución en la toxicidad del LPS, así como una disminución de lípido A. Además, se observa un aumento en la resistencia a diferentes antibióticos, como la vancomicina, rifampicina y azitromicina.Conclusiones: La inhibición de genes de la biosíntesis de LPS en Acinetobacter baumannii resulta no sólo en una reducción de los niveles de toxicidad de LPS, sino también en una disminución de LPS al tratar con inhibidor de LpxC. Esta disminución de LPS reduce la resistecia de A. baumannii a diferentes clases de antibióticos.

Effect of disinfectants used in clinical facilities on the induction of the SOS response and mutation frequency in Escherichia coli

Motivation: The development of antibiotic resistance is one of the mechanism used to study adaptive evolution. Antibiotics not only select for preexisting resistant strains in a population, but they can also promote the appearance of resistant strains (1, 2). Antibiotics at high concentrations can be lethal to bacteria, but it has been shown that sub-inhibitory concentrations of some antibiotics can stimulate horizontal transfer of DNA and mutation in different chromosomal loci (1, 3). These antibiotics can increase the mutation rate through several mechanisms, such as oxidative stress and the SOS response, which is triggered by DNA damage (2, 3). In this context, we wanted to determine if commonly-used disinfectants also promote mutation. Methods: The disinfectants used were ethanol, sodium hypochlorite, chlorhexidine, silver nitrate, benzalkonium chloride, triclosan and povidone-iodine complex. The E.coli strain used was IBDS1, which includes a tetracycline gene regulated by the cI (Ind-) repressor gene, that allows us to measure the mutation rate.To study the effect of these disinfectants, the strain IBDS1 was tested with a window of concentrations very close to the minimum inhibitory concentration (MIC) by evaluating the appearance of mutants resistant to rifampicin or tetracycline (3). To determine if this effect could be linked to the induction of the SOS system, we used a plasmid which expresses the "Green Fluorescence Protein" (GFP) under the control of the promoter of the recA gene to detect when the SOS system is activated by measuring fluorescence.Results: Three of the disinfectants tested increased mutation frequency. Concentrations of 0.013 μg/ml and 0.026 μg/ml of NaClO (1/4x CMI y 1/2x MIC) increased the mutation frequency approximatly 4 fold and 0.5 μg/ml of clorhexidine (1/4x MIC) and 0.125 μg/ml of triclosan (1/4x MIC) 3 fold, approximately. In relation to the SOS system, none of the concentrations tested induced the SOS response. Conclusions: These results show that certain concentrations of sodium hypochlorite, chlorhexidine and triclosan increase the mutation frequency and therefore may facilitate the appearance of resistant strains, although it appears that this mutagenic effect is not related to the induction of the SOS system. Therefore, it would be interesting to study whether this mutagenic effects is due to the reactive oxygen species (ROS) produced by disinfectants.

Genetic and molecular analysis of the virulence plasmid of Salmonella enterica serovar Typhimurium

Salmonella enterica serovar Typhimurium posee un plásmido de gran tamaño (93 Kb) llamado plásmido de virulencia o pSLT. Dicho plásmido contiene el locus spv, esencial para la infección sistémica en roedores. El plásmido fue presumiblemente adquirido por el hospedador ancestral de Salmonella mediante conjugación. En la mayoría de las estirpes del serovar Typhimurium, el plásmido pSLT contiene un operón tra completo. En esta tesis se han realizado diversos análisis estructurales y funcionales en el plásmido pSLT, habitualmente empleando estrategias genéticas (sobre todo, uso de mutantes).En condiciones de laboratorio, la adición de desoxicolato sódico a los cultivos permite la detección de aislados curados del plásmido. Ello sugiere que la estabilidad de pSLT puede hallarse comprometida en vivo, ya que las sales biliares alcanzan concentrationes notables en el intestino delgado y especialmente en el duodeno. La síntesis de los pili conjugativos codificados por pSLT no causa sensibilidad a bilis, a diferencia de lo que ocurre con los pili codificados por el plásmido F. Es posible que el paso de Salmonella por el tracto hepatobiliar a lo largo de millones de años haya seleccionado variantes del plásmido de virulencia resistentes a bilis.La frecuencia de curación de pSLT en presencia de desoxicolato sódico aumenta en un mutante carente del módulo de adicción CcdAB. Ello sugiere que dicho módulo es funcional en Salmonella.La posibilidad de que el plásmido de virulencia sufra curación en el duodeno plantea la posibilidad de que la conjugación tenga un alto valor selectivo durante la infección de animales. Dado que las células curadas del plásmido de virulencia tienen menor capacidad de infección sistémica, recuperar el plásmido pSLT en el propio intestino podría tener valor adaptativo.La transferencia del plásmido de virulencia durante la infección del ratón se detecta con relativa facilidad, ya que las frecuencias de conjugación son sorprendentemente altas. Sustancias típicas del duodeno (bilis) y del intestino grueso (propionato) inhiben la frecuencia de transmisión conjugativa de pSLT. Perece probable que la conjugación dentro del ratón tenga lugar en el íleon. Esta hipótesis es apoyada por la detección de transconjugantes a alta frecuencia en asas de íleon de ratón.Un factor clave en la regulación de la transferencia conjugativa de pSLT es la actividad del sistema FinOP de inhibición de la fertilidad. Un ensayo de análisis transcriptómico mostró que el ARN FinP tenía dianas en el cromosoma. Una de ellas es el gen biosintético cysD. En presencia de RNA FinP, la cantidad de transcrito cysDNC aumenta. También se observa un aumento a nivel de proteína. La deleción del gen cysD aumenta la frecuencia de conjugación un orden de magnitud, proporcionando un indicio de que la biosíntesis de cisteína afecta a la conjugación. Ya que la proteína CysD está implicada en la ruta biosintética de la cisteína a partir de sulfato, se estudió si el fenotipo conjugativo de la deleción era debido a una segunda función de CysD o a su implicación en la biosíntesis de L-cisteína. La interrupción de la ruta en otro paso indicó que la biosíntesis de cisteína estaba implicada en la transferencia del plásmido. Además, los productos finales de la ruta (sulfuro y cisteína) producen una disminución en la frecuencia de conjugación. Por tanto, FinP inhibe la transferencia del plásmido de virulencia a través de dos vías: i) como ARN antisentido de traJ; e ii) aumentando los niveles de L-cisteína a través de dianas cromosómicas en trans, y específicamente aumentando la expresión del operón cysDNC.Finalmente, se ha estudiado la posible adaptación de los plásmidos de virulencia a su hospedador. Para ello se calcularon las frecuencias de conjugación de tres estirpes diferentes: LT2, ATCC 14028 y SL1344. Cada estirpe mostró tener una frecuencia específica de conjugación, que dependía únicamente del propio plásmido. En la estirpe SL1344 la frecuencia de conjugación era más baja, y la causa principal parece hallarse en una mutación en el gen traG. Sin embargo, los tres plásmidos son totalmente intercambiables para la virulencia. Estos resultados, junto con la abundancia de deleciones en los operones tra de otros serotipos (y en menor medida en aislados naturales del serovar Typhimurium) sugieren que los genes spv están sometidos a selección, mientras que los genes tra son más o menos neutros. Si esta interpretación es correcta, parece plausible que los plásmidos de virulencia de Salmonella evolucionen hacia formas no autotransmisibles

Impact of evening carbohydrate intake on the resolution of persistent night sweats in patients with long COVID: a case series

Up to 25% of patients with long COVID experience persistent night sweats. However, in most cases they remain untreated until they disappear on their own. Since SARS-CoV-2 is known to disrupt glucose homeostasis, we hypothesized that impaired mitochondria would result in faster glycogen depletion at night due to reduced ATP production yield, inducing adrenaline production ultimately leading to the onset of persistent night sweats. To test our hypothesis we investigated whether incorporating carbohydrates into the diet of three non-diabetic patients with long COVID before bedtime would have any effect decreasing their night sweats. Remarkably, after one week with the dietary intervention, the patients reported that their night sweats had completely disappeared. Therefore, we propose carbohydrate supplementation as an affordable solution for night sweats in long COVID patients

Phages in Food Industry Biocontrol and Bioremediation

Bacteriophages are ubiquitous in nature and their use is a current promising alternative in biological control. Multidrug resistant (MDR) bacterial strains are present in the livestock industry and phages are attractive candidates to eliminate them and their biofilms. This alternative therapy also reduces the non-desirable effects produced by chemicals on food. The World Health Organization (WHO) estimates that around 420,000 people die due to a foodborne illness annually, suggesting that an improvement in food biocontrol is desirable. This review summarizes relevant studies of phage use in biocontrol focusing on treatments in live animals, plants, surfaces, foods, wastewaters and bioremediation

First Steps Towards a Vaccine against Acinetobacter baumannii

Acinetobacter baumannii has become an important cause of human infections, most notably in the hospital setting. In addition, the global dissemination of multidrug resistant strains has complicated effective antibiotic therapy of infections produced by this pathogen, necessitating the development of novel treatment and prevention strategies. Active and passive immunization approaches have begun to be explored in experimental animal models as potential alternative therapies for A. baumannii. In the present review, we discuss the advantages and disadvantages of each therapeutic strategy with respect to A. baumannii infections, and summarize the recent studies that have explored these approaches. The single antigen candidates that have been tested include, the outer membrane protein OmpA, the membrane transporter Ata, the biofilm-associated protein Bap, the K1 capsular polysaccharide and the membrane associated polysaccharide poly-N-acetyl-β -(1-6)-glucosamine. Strategies employing multicomponent antigens include inactivated whole cells, outer membrane complexes and outer membrane vesicles. The strengths and limitations of each approach are discussed and the challenges that remain to be addressed for successful A. baumannii vaccine development are highlighted.European Community\'s 7 th Programme Framework (MagicBullet) 278232European's Development Regional Fund "A way to achieve Europe" ERDF, Spanish Network for the Research in Infectious Diseases REIPI RD06/0008/0000European\'s Development Regional Fund "A way to achieve Europe" ERDF, Spanish Network for the Research in Infectious Diseases REIPI RD06/0008/0000Ministerio de Econom a y Competitividad of Spain CP11/00314Ministerio de Econom a y Competitividad, Instituto de Salud Carlos II

Immunization with Lipopolysaccharide-Deficient Whole Cells Provides Protective Immunity in an Experimental Mouse Model of Acinetobacter baumannii Infection

Editor: Gunnar F. KaufmannThe increasing clinical importance of infections caused by multidrug resistant Acinetobacter baumannii warrants the development of novel approaches for prevention and treatment. In this context, vaccination of certain patient populations may contribute to reducing the morbidity and mortality caused by this pathogen. Vaccines against Gram-negative bacteria based on inactivated bacterial cells are highly immunogenic and have been shown to produce protective immunity against a number of bacterial species. However, the high endotoxin levels present in these vaccines due to the presence of lipopolysaccharide complicates their use in human vaccination. In the present study, we used a laboratory-derived strain of A. baumannii that completely lacks lipopolysaccharide due to a mutation in the lpxD gene (IB010), one of the genes involved in the first steps of lipopolysaccharide biosynthesis, for vaccination. We demonstrate that IB010 has greatly reduced endotoxin content (,1.0 endotoxin unit/106 cells) compared to wild type cells. Immunization with formalin inactivated IB010 produced a robust antibody response consisting of both IgG1 and IgG2c subtypes. Mice immunized with IB010 had significantly lower post-infection tissue bacterial loads and significantly lower serum levels of the pro-inflammatory cytokines IL-1b, TNF-a and IL-6 compared to control mice in a mouse model of disseminated A. baumannii infection. Importantly, immunized mice were protected from infection with the ATCC 19606 strain and an A. baumannii clinical isolate. These data suggest that immunization with inactivated A. baumannii whole cells deficient in lipopolysaccharide could serve as the basis for a vaccine for the prevention of infection caused by A. baumannii.REIPI REIPI RD06/0008/0000Consejería de Salud de la Junta de Andalucía (PI-0046-2011)Ministerio de Economía y Competitividad, Subprograma Miguel Servet (CP11/00314