Left ventricular diastolic dysfunction in Nrf2 knock out mice is associated with cardiac hypertrophy, decreased expression of SERCA2a, and preserved endothelial function

AbstractIncreased production of reactive oxygen species and failure of the antioxidant defense system are considered to play a central role in the pathogenesis of cardiovascular disease. The transcription factor nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2) is a key master switch controlling the expression of antioxidant and protective enzymes, and was proposed to participate in protection of vascular and cardiac function. This study was undertaken to analyze cardiac and vascular phenotype of mice lacking Nrf2. We found that Nrf2 knock out (Nrf2 KO) mice have a left ventricular (LV) diastolic dysfunction, characterized by prolonged E wave deceleration time, relaxation time and total diastolic time, increased E/A ratio and myocardial performance index, as assessed by echocardiography. LV dysfunction in Nrf2 KO mice was associated with cardiac hypertrophy, and a downregulation of the sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA2a) in the myocardium. Accordingly, cardiac relaxation was impaired, as demonstrated by decreased responses to β-adrenergic stimulation by isoproterenol ex vivo, and to the cardiac glycoside ouabain in vivo. Surprisingly, we found that vascular endothelial function and endothelial nitric oxide synthase (eNOS)-mediated vascular responses were fully preserved, blood pressure was decreased, and eNOS was upregulated in the aorta and the heart of Nrf2 KO mice. Taken together, these results show that LV dysfunction in Nrf2 KO mice is mainly associated with cardiac hypertrophy and downregulation of SERCA2a, and is independent from changes in coronary vascular function or systemic hemodynamics, which are preserved by a compensatory upregulation of eNOS. These data provide new insights into how Nrf2 expression/function impacts the cardiovascular system

Abstracts from the 8th International Conference on cGMP Generators, Effectors and Therapeutic Implications

This work was supported by a restricted research grant of Bayer AG

Physiologische Bedeutung der alpha-Untereinheiten der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase

Die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase, die durch die Bildung von cGMP das NO-Signal in eine Erhöhung der intrazellulären cGMP-Konzentration umsetzt, besitzt eine zentrale Position innerhalb der NO/cGMP-vermittelten Signaltransduktionskaskade. Dabei kann das NO als Signalmolekül von zwei NO-Synthasen-Isoformen gebildet werden, der neuronalen und der endothelialen NO-Synthase. Strukturell besteht die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase aus zwei verschiedenen Untereinheiten, a und b, und enthält eine prosthetische Häm-Gruppe, an der NO bindet. Für jede der Untereinheiten der Guanylyl-Cyclase wurden bisher durch Homologie-Klonierung zwei cDNA-Sequenzen (a1, a2 und b1, b2) isoliert, jedoch konnte auf Proteinniveau das physiologische Vorkommen von nur zwei (a1b1, a2b1) der theoretisch zu erwartenden vier Heterodimere gezeigt werden. Zwischen den a1b1- und a2b1-Heterodimeren konnten weder enzymatische noch regulatorische Unterschiede nachgewiesen werden, und so stellte sich bald die Frage nach der physiologischen Relevanz der beiden Isoformen. Eine funktionelle Differenzierung und Analyse dieser ansonsten sehr ähnlichen Isoformen (a1b1, a2b1) kann mit Hilfe von Knock-out-Mausmodellen erfolgen, in denen das a1- bzw. a2-Gen der Guanylyl-Cyclase inaktiviert ist bzw. induzierbar inaktiviert werden kann. In der vorliegenden Arbeit wurden embryonale Stammzelllinien der Maus generiert, in denen das Gen der a1- bzw. a2-Untereinheit modifiziert wurde. Dabei wurde gezielt jeweils ein wichtiges Exon mit spezifischen Erkennungssequenzen (loxP-Sequenzen) des Enzyms Cre-Rekombinase versehen. Die Erkennungssequenzen ermöglichen später in Abhängigkeit von der Expression der Cre-Rekombinase die induzierbare Deletion des Exons, so dass die Bildung einer funktionellen a-Untereinheit unterbunden wird. Die genomische Veränderung der embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) wurde durch Transfervektoren (targeting-Vektoren) erzielt, die lange genomische Sequenzen der jeweiligen a-Untereinheit enthielten, und sich deshalb an Stelle der endogenen Sequenzen in das Genom der ES-Zellen integrierten. Für die Konstruktion der targeting-Vektoren musste die genomische Organisation der a-Untereinheiten der Maus partiell analysiert, die entsprechenden genomischen Abschnitte isoliert, und diese dann mit den entsprechenden Restriktionsschnittstellen versehen und subkloniert werden. Nach Einbringen der Transfervektoren in die ES-Zellen musste die richtige Integration an der Zielposition im Genom bzw. auch die Anwesenheit der Cre-Rekombinase-Erkennungssequenzen sichergestellt werden. Hierzu wurden genomische Southern-Blots und PCR-Analysen entwickelt, die auch im weiteren für die Etablierung der Mauslinien unerlässlich sind. Aus in der vorliegenden Arbeit generierten ES-Zellen sind Mäuse entstanden, sogenannte Chimären. Diese chimären Mäuse werden zurzeit verpaart, um Nachkommen zu erzeugen, in denen das Gen der a1- bzw. a2-Untereinheit in allen Zellen modifiziert vorliegt. Durch die anschließende Verpaarung mit transgenen Cre-Rekombinase-Mäusen werden Mausmodelle generiert, in denen die jeweilige a-Untereinheit der Guanylyl-Cyclase zu ausgewählten Zeitpunkten bzw. gewebsspezifisch ausgeschaltet werden kann. In Hinblick auf die Möglichkeit einer gewebsspezifischen Inaktivierung des a1- bzw. a2-Gens sind Kenntnisse über die Gewebeverteilung der a-Untereinheiten von großer Bedeutung. Deshalb wurde im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit die relative Gewebeverteilung der Untereinheiten (a1, a2, und b1) der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase in Mausgewebe systematisch untersucht. Die relative Quantifizierung der mRNA der a1-, a2-, und b1-Untereinheit wurde mittels real-time quantitativer PCR durchgeführt. Die Lunge und das Gehirn wurden als die beiden Gewebe mit dem höchsten Guanylyl-Cyclase-Gehalt identifiziert. In der Lunge wie auch in den weiteren untersuchten peripheren Organen stellte das a1b1-Heterodimer die überwiegend exprimierte Guanylyl-Cyclase-Isoform dar, während das a2b1-Heterodimer hauptsächlich im Gehirn nachgewiesen wurde. Insbesondere wurden der Hippokampus und das Kleinhirn als die Hirnregionen mit dem höchsten a2b1-Guanylyl-Cyclase-Gehalt identifiziert, für die eine Beteiligung der NO/cGMP-Signaltransduktion an einigen Formen der synaptischen Plastizität diskutiert wird. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass die a2-Untereinheit spezifisch mit Adapterproteinen interagiert, die eine Verankerung des a2b1-Heterodimers an synaptischen Membranen vermitteln; die a1b1- und a2b1-Guanylyl-Cyclasen weisen also unterschiedliche subzelluläre Lokalisationen auf. Aufgrund der subzellulären Lokalisation und der in der vorliegenden Arbeit ermittelten Gewebeexpression der beiden Guanylyl-Cyclase-Isoformen lässt sich die Hypothese aufstellen, dass die a2b1-Guanylyl-Cyclase hauptsächlich durch das NO der neuronalen NO-Synthase stimuliert wird, während die a1b1-Guanylyl-Cyclase primär die Effekte des von der endothelialen NO-Synthase gebildeten NO weiterleitet

Spare guanylyl cyclase NO receptors ensure high NO sensitivity in the vascular system

In the vascular system, the receptor for the signaling molecule NO, guanylyl cyclase (GC), mediates smooth muscle relaxation and inhibition of platelet aggregation by increasing intracellular cyclic GMP (cGMP) concentration. The heterodimeric GC exists in 2 isoforms (α(1)-GC, α(2)-GC) with indistinguishable regulatory properties. Here, we used mice deficient in either α(1)- or α(2)-GC to dissect their biological functions. In platelets, α(1)-GC, the only isoform present, was responsible for NO-induced inhibition of aggregation. In aortic tissue, α(1)-GC, as the major isoform (94%), mediated vasodilation. Unexpectedly, α(2)-GC, representing only 6% of the total GC content in WT, also completely relaxed α(1)-deficient vessels albeit higher NO concentrations were needed. The functional impact of the low cGMP levels produced by α(2)-GC in vivo was underlined by pronounced blood pressure increases upon NO synthase inhibition. As a fractional amount of GC was sufficient to mediate vasorelaxation at higher NO concentrations, we conclude that the majority of NO-sensitive GC is not required for cGMP-forming activity but as NO receptor reserve to increase sensitivity toward the labile messenger NO in vivo